外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响

1、外源性碱性成纤维细胞生长因子对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响【摘要】 目的 研究外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对吸烟大鼠脑细胞凋亡及p53表达的影响。方法 将40只大鼠随机分为4组：正常对照组、长期大量吸烟组、短期大量吸烟组、吸烟+bFGF组（吸烟最后15 d经腹腔内注射bFGF）。采用线栓大脑中动脉法建立大鼠脑梗死模型。采用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL法）及免疫组化法检测细胞凋亡和p53蛋白表达。结果 各吸烟组脑细胞凋亡及p53蛋白表达较对照组明显增加(P0.01)，凋亡细胞数量和p53蛋白表强度随吸烟时间和剂量增加而增加(P0.01)。bF

2、GF治疗组大鼠脑细胞凋亡数及p53蛋白表达较单纯吸烟组明显减少(P0.01)。结论 吸烟可使大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达增加，p53介导吸烟诱导的细胞凋亡，细胞凋亡及p53蛋白表达强度与吸烟时间及数量相关，bFGF 通过抑制p53表达减少细胞凋亡。 【关键词】 外源性碱性成纤维细胞生长因子；吸烟；凋亡；p53；脑细胞凋亡与缺血性脑损伤密切相关。近年来研究发现，吸烟或烟雾暴露可诱导脑细胞发生凋亡，。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是很有临床应用价值的一种神经营养因子，其神经活性广泛，能保护神经元，促进神经生长，具有抗缺血性脑损伤的作用。目前国内外尚无关于外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡影响

3、的报道。本实验将外源性bFGF应用于吸烟大鼠，通过对大鼠脑细胞凋亡及p53蛋白表达进行比较，探讨外源性bFGF对吸烟所致脑细胞凋亡的作用及其机制，为临床应用bFGF提供理论依据。1 材料与方法1.1 动物吸烟模型的建立及分组 健康成年雄性Wister大鼠40只（由中国医科大学实验动物中心提供），体重200250 g，随机平均分成4组：（1）正常对照组；（2）长期大量吸烟组：燃烧香烟10支×2次/d，共90 d ；（3）短期大量吸烟组：燃烧香烟10支×2次/d，共45 d；（3）长期大量吸烟+bFGF组：吸烟量及时间与（2）组相同，于吸烟最后15 d腹腔内注射bFGF。各吸烟

4、组均用尼古丁含量为1.5 mg/支的市售某品牌香烟，置于80 cm×60 cm×40 cm大小的自制烟熏箱中，实验期间各组大鼠饲养条件一致。1.2 标本制备 各组大鼠用10%水合氯醛麻醉后，开胸经心腔快速灌注肝素化生理盐水250 ml，用4%多聚甲醛磷酸缓冲液（4，0.1 mol/L PBS配置，pH7.4），灌注固定30 min。断头取脑，置于4相同浓度的多聚甲醛缓冲液中固定过夜，常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚约5 m。相邻切片分别行TUNEL及免疫组化染色。1.3 TUNEL法检测细胞凋亡 凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物试剂公司。切片依次经二甲苯脱蜡，剃度酒精水化，

5、蛋白酶K 20 g/ml 37消化15 min，TBS（pH7.4）洗5 min，3次。滴加TUNEL反应液（TdT 1 l，DIGdUTP 1 l，18 l标记缓冲液，20 l/片），37孵育2 h。TBS洗2 min，3次;加生牡素化地高辛抗体，37孵育30 min，TBS洗2 min，3次;DAB显色，苏木素复染。TBS洗。树胶封片。阴性对照TUNEL反应液中去掉了TdT酶，其余操作同上。1.4 免疫组化染色 p53多克隆抗体购自武汉博士德生物试剂公司。切片常规脱蜡入水。0.3%过氧化氢37作用10 min灭活内源性酶。0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）高压修复2 min左

6、右，冷却至室温，滴加5%BSA封闭液37，20 min。加p53抗体，4过夜。PBS洗5 min，3次;加生物素化羊抗兔IgG 37孵育 20 min，PBS洗2 min，3次。滴加SABC 37，20 min。PBS洗3 min，5次。DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余操作同上。1.5 图像分析与数据处理 用显微成像系统采集图片，计算并分析阳性细胞平均灰度值，数据用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，各组间比较用两样本均数比较的t检验。2 结果2.1 大鼠脑细胞凋亡 见表1。镜下凋亡细胞TUNEL阳性染色为褐色圆形或椭圆形实心小

7、体。正常对照组偶有散在的凋亡细胞。各吸烟组与正常对照组相比，凋亡细胞明显增多（P0.01）。长期大量吸烟组凋亡细胞较短期大量吸烟组明显增多（P0.01）。bFGF治疗组凋亡细胞较两单纯吸烟组明显减少，但仍较正常对照组明显增多（P0.01）。凋亡细胞分布以海马区最多，皮质及其他脑区亦可见到。2.2 p53 蛋白表达 见表1。光镜下可见核为蓝色、胞浆为棕色的p53阳性细胞。正常对照组有少量阳性表达，各吸烟组p53阳性细胞较正常对照组明显增多（P0.01）。长期大量吸烟组p53表达较短期大量吸烟组明显增多（P0.01）。bFGF治疗组p53表达较两单纯吸烟组明显减少，但仍较正常对照组明显增多（P0.

8、01）。p53阳性细胞分布以海马区最多，皮质及其他脑区亦可见到，与凋亡细胞分布一致。表1 吸烟大鼠脑内凋亡细胞及p53阳性细胞平均灰度（略）与正常对照组比较：1)P0.01，与长期大量吸烟组比较：2)P0.013 讨论 吸烟是缺血性脑血管病重要的可干预危险因素之一。吸烟或烟雾暴露已被证明可诱导多种组织细胞发生凋亡1，2，也可诱导脑细胞发生凋亡3。本实验结果显示，正常大鼠脑组织内仅有个别散在的凋亡细胞，而各吸烟组脑组织凋亡细胞明显增加，并且与吸烟时间和数量成正相关。 p53基因是一种促凋亡基因，有野生型和突变型两种，正常存在于细胞内的p53基因为野生型。实验发现野生型p53表达增加能活化其他促凋

9、亡基因的转录，使细胞进入凋亡过程，细胞的凋亡数与野生型p53基因拷贝数呈正相关4。有人认为野生型p53可能起着启动细胞死亡程序的作用5。p53同时也是缺血损伤时敏感而可靠的标志，缺血缺氧、DNA损害均能刺激p53基因表达明显增加，导致野生型蛋白聚集，从而诱导细胞凋亡。本实验结果表明，各吸烟组大鼠脑内p53蛋白表达较正常对照组明显增加，与吸烟时间和数量成正相关，并且与凋亡细胞分布一致。 bFGF是一种具有多种生物学活性的多肽。正常情况下，脑内只有轻度的bFGF表达，但在大脑发育期、损伤或中风发生时表达水平上调6。用放射性标记的bFGF检测发现在正常情况下，外源性bFGF不能通过血脑屏障；而当脑组

10、织受到各种损伤时，bFGF则能通过受损的血脑屏障发挥其神经保护作用7。本实验发现吸烟后腹腔内注射bFGF大鼠的脑细胞凋亡数较单纯吸烟大鼠均明显减少，促凋亡基因p53表达也明显降低，说明吸烟导致血脑屏障受损，外源性bFGF通过受损的血脑屏障，对吸烟引起的脑组织损伤发挥一定的保护作用。bFGF的脑保护作用可能通过多种途径实现：（1）bFGF可增加两种重要的抗氧化酶(Cu/Zn过氧化物歧化酶和谷胱还原酶)的活性来对抗缺血后的谷氨酸兴奋毒性损伤8；（2）bFGF能抑制海马神经元内一种71 kDa NMDA受体相关蛋白表达9，对抗NMDA的神经毒性，近来研究还表明bFGF能增加NMDA受体拮抗剂（MK8

11、01）的抗缺血后神经损害作用10；（3）细胞内Ca2+超载是缺血性脑损伤的关键因素，bFGF能维持细胞内Ca2+内环境稳定，阻止Ca2+内流11；（4）bFGF还有降低NO神经毒性的作用12；（5）bFGF直接营养胶质细胞、血管和神经元：可作为胶质营养因子促进胶质细胞分化，又可作为血管源性因子促进脑血管内皮细胞及血管增生，以抵抗缺血的损伤。 本实验进一步证实了吸烟能诱导脑组织细胞发生凋亡及p53蛋白表达增加，且两者表达强度与吸烟时间和数量成正相关。外源性bFGF可减少脑细胞凋亡，降低促凋亡基因p53表达。bFGF的应用为临床治疗吸烟所致的缺血性脑血管病提供了一个有效方法，但其最佳作用剂量及临床

12、应用的远期效果尚需进一步观察研究。【参考文献】 1 Hoshino Y，Mio T，Nagai S，et al.Cytotoxic effects of cigarette smoke extract on alveolar type II cellderived cell line J.Am J Physilo Lung Cell Mol Physiol，2001;281(2):50916.2 Wang H，Ma L，Li Y，et al.Exposure to cigarette smoke increases apoptosisi in the rat gastric mucosa th

13、rough a reactive oxygen speciesmediated and p53independent pathway J.Free Radic Biol Med，2000;28(7):112531.3 李 华，柳忠兰，薛喜峰.吸烟大鼠脑细胞凋亡与蛋白表达J.中风与神经疾病杂志，2003;3:2168.4 Colombel M，Olsson CA，Ng PY，et al.Hormoneregulated apoptosis results from reentry of differentiated prostate cells onto a defective cell cyc

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