儿童急性白血病细胞视网膜母细胞瘤蛋白的表达及临床意义

1、儿童急性白血病细胞视网膜母细胞瘤蛋白的表达及临床意义 作者：袁向亮，赵惠君，蒋黎敏，徐，袁晓军，汤静燕，沈立松【摘要】 本研究检测视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein, pRb）在不同类型儿童急性白血病细胞中的表达，并探讨其表达水平与细胞周期、危险度、微小残留病（minimal residual disease, MRD）监测、预后等临床诊断治疗监测指标的关系。对89例初发小儿急性白血病患者（包括25例AML, 10例T-ALL, 54例B-ALL）及7例正常对照骨髓标本，采用流式细胞术（FCM）分别检测治疗前后视网膜母细胞瘤蛋白的表达情况，并对部分病例进行细胞周期

2、分析。 结果表明： 流式细胞术检测pRb的表达准确直观；在各种类型的急性白血病中pRb的高水平表达具有普遍性，同一患儿白血病细胞pRb的表达明显高于非白血病细胞，在不同类型的急性白血病中pRb均有缺失表达； pRb的表达水平与白血病细胞的细胞循环周期可能存在一定的相关性，pRb表达阳性的B-ALL中处于G1期的白血病细胞数显著高于pRb表达阴性的病例(92% vs 77%)； B-ALL中，MRD阳性组pRb的表达量明显低于阴性组，且差值有统计学意义（P<0.05），并且治疗前后非白血病细胞的pRb表达水平是稳定的； pRb的表达量与B-ALL早期治疗预后之间存在一定相关性，B-

3、ALL预后不良组pRb的表达量低于预后良好组（P<005）。结论： pRb在儿童急性白血病细胞中存在高水平表达或缺失等异常形式的表达差异，pRb的表达与白血病细胞的细胞周期、MRD监测、早期治疗反应的预后评价等存在相关性，对于B-ALL的治疗监测及预后评估具有指导意义。 【关键词】 急性白血病； 儿童急性白血病；视网膜母细胞瘤蛋白； MRD监测Expression of Retinoblastoma Protein in Child Acute Leukemia Cells and Its Clinical SignificanceAbstractThe research was

4、 aimed to detect the expression levels of retinoblastoma protein (pRb) in child acute leukemia cells, and to explore its possible association with leukemia cells cycle, the risk of disease, minimal residual disease (MRD) monitoring and prognosis of B-ALL. Flow cytometry (FCM) was used to detect the

5、expression of pRb in 89 cases of acute leukemia (including 25 AML, 10 T-ALL and 54 B-ALL) and bone marrows from 7 normal children (control group). Meanwhile the cell cycle in some cases was analyzed . The results showed that (1) the FCM could accurately detect the expression of pRb in acute leukemia

6、 cells; (2) the high level of pRb expression was frequent in all types of child acute leukemias. In the same case, the expression of pRb was significantly increased in leukemia cells when compared with non-leukemia cells. And no detectable pRb protein was found in partial cases of acute leukemia; (3

7、) there was a close relation between expression of pRb and the cell cycle of leukemia cells, the number of G1 phase cells in pRb positive case of B-ALL was more than that in pRb negative case (92% vs 77%); (4) in B-ALL, the level of pRb expression in MRD positive group was significantly lower than t

8、hat in MRD negative group (P<0.05), but pRb expression was stable in non-leukemia cells during therapy; (5) pRb expression was related to the early response to therapy in B-ALL, the expression of pRb was significantly increased in sensitive group when compared with insensitive group (P&lt

9、;005). It is concluded that high level or absence of pRb expression can be found in child acute leukemia cells. The expression of pRb is positively related to cell cycle of leukemia cells, MRD monitoring and the early response to therapy. In short, the detection of pRb expression level can guide the

10、 therapy and the evaluation of prognosis in B-ALL.Key worksacute leukemia; child acute leukeima; retinoblastoma protein; MRD monitor视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein, pRb）作为细胞周期的重要调控因子以及它的基因作为第一个被克隆的抑癌基因在视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌等多种肿瘤中异常表达、缺失或突变等，在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。以往研究表明，急性白血病细胞中pRb的表达状态与白血病细胞对化疗的敏感性及患者生存期有关1

11、，2。因此研究pRb的表达情况对阐明白血病的发病机制及对于白血病的诊断、治疗监测具有重要意义。本研究采用流式细胞术对89例小儿急性白血病患者（包括AML、T-ALL、B-ALL）标本的检测，研究pRb蛋白在急性白血病的表达情况以及pRb蛋白的表达水平及其与细胞周期、急性B淋巴系白血病危险度分期、微小残留病（minimal residual disease, MRD）监测和治疗预后的相关性。材料和方法病例2003年2月2004年11月，上海儿童医学中心收治的初发急性白血病患儿89例。在89例中急性B淋巴系白血病（B-ALL）54例，男32例，女22例，中位年龄5岁；急性T淋巴系白血病（T-ALL

12、）10例，男9例，女1例，中位年龄6岁；急性髓性白血病(AML)25例，男17例，女8例，中位年龄7岁。所有患者都经FAB分型法以及流式细胞术免疫分型法确诊，并用PVDL（泊尼松、长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶）方案进行诱导缓解治疗。在第1疗程结束而达到临床缓解后，对部分B-ALL病例进行MRD监测。正常对照7例，均为上海儿童医学中心儿保科体检正常的儿童，中位年龄6.6岁。主要仪器与试剂流式细胞仪（FACS Calibure Becton Dickinson产品）；Anti-pRb-FITC (Becton Dickinson PharMingen产品)； 鼠IgG1-FITC(Becto

13、n Dickinson PharMingen产品)作为同型对照；CD45-PC5；8E透膜剂(美国St.Jude Children's Research Hospital, Dr Dario Campana 赠送)；胎牛血清（Gibco产品）；牛血清白蛋白（Sigma产品）； Ficoll淋巴细胞分离液。标本收集及处理取白血病患者和正常儿童0.5 ml骨髓液，用Ficoll 分离液分离单个核细胞，用PBSA (含0.2 % 牛血清白蛋白及0.2 % 叠氮钠的PBS)洗2遍后悬浮。调节每管细胞数为（2-3） ×106, 先用表面抗原标志CD45-PC5标记，孵育10分钟。用PB

14、SA洗2 遍，加入8E透膜剂避光40分钟。离心5分钟去上清，加入Wash 缓冲液(含5 % 胎牛血清，1.5 % 牛血清白蛋白，0.0055% EDTA 和0.2% 叠氮钠的PBS) 10分钟。离心去上清，用Wash 缓冲液再洗1遍。加入Anti-pRb-FITC和鼠IgG1-FITC抗体进行胞浆染色10分钟，用Wash 缓冲液洗2 遍，多聚甲醛悬浮待用。作细胞周期分析时，作PI DNA染色处理，先将细胞用30%乙醇固定，37孵育20分钟，PI染液染色，室温封闭至上机分析。流式细胞术检测分析用FACS Calibur流式细胞仪检测，测定前先用标准荧光微球校准仪器。用CellQuest软件(ve

15、rsion 3. 2)获取分析10 000个细胞。不同的抗体组合及不同的患者标本都用同一设定条件检测。应用CD45/SSC设门法将不同型的白血病细胞与正常细胞分离开来。pRb表达水平以除去阴性对照的百分比例表示。每一标本均进行免疫分型检测，并对B-ALL病例进行MRD筛选。MRD监测患者诱导治疗结束后的骨髓标本，经Ficoll分离液分离单个核细胞后, 用筛选时确认为有效的抗体组合进行4色荧光标记检测。应用Shen等建立的B-ALL MRD监测方法检测3。早期预后反应判定根据上海儿童医学中心ALL-XH-99及NHL-99方案按序化疗： ALL患儿以治疗第7天强的松试验作为肿瘤细胞对激素治疗的敏

16、感性评估指标。强的松治疗第7天外周血白血病细胞下降至1 000/l为强的松反应良好（pGR）组，1 000/l 为强的松反应不良（pPR）组； ALL患儿以第19天骨髓像及MRD检测作为肿瘤细胞对早期联合化疗的敏感性评估指标。第19天骨髓中镜下原始淋巴细胞小于5%，MRD阴性定为早期联合化疗反应良好组，大于5%，MRD阳性则为早期联合化疗反应不良组； 以治疗第35±10天达缓解及部分缓解作为早期联合化疗反应良好组，反之为早期联合化疗反应不良组。以上标准只要符合其中一项，或不符合但治疗过程中死亡、发生急性粒细胞白血病变等情况即被列为预后不好，反之为预后良好。统计学处理应用SPSS 11

17、.5和Sigma Plot 9.0统计软件，对pRb值作相关分析。对各组数据首先进行正态性检验，正态分布数据以±SD表示，非正态分布数据以中位数M及其5%-95%分布范围表示，组间数据分析采用秩和检验。率的比较采用2检验。相关性采用线性相关分析。P值<0.05作为统计学有显著性意义标准。结果pRb在儿童急性白血病中的表达流式细胞术检测白血病细胞中pRb的表达由于白血病患儿骨髓标本中的白血病细胞CD45表达较正常细胞偏低，应用CD45/SSC设门法可以将患者骨髓中白血病细胞与正常细胞分离开来。在直方图中以除去阴性对照的Anti-pRb-FITC荧光表达区域设门M1，计算p

18、Rb的表达百分数，以此来评估患儿肿瘤细胞的pRb表达水平。对每一例标本同时设门检测白血病细胞与非白血病细胞的pRb表达情况，结果见图1。pRb在儿童急性白血病中的表达儿童急性白血病患儿骨髓肿瘤细胞的视网膜母细胞瘤蛋白的表达值呈非正态分布，其具体表达量见附表。各类白血病中肿瘤细胞pRb的表达量明显高于正常水平，与正常对照相比均存在显著性差异（AML P=0.019, T-ALL P=0.002, B-ALL P=0001）。并且在同一类急性白血病中白血病细胞pRb 的表达量显著高于非白血病细胞，差异均有统计学意义（P<0.05）。急性白血病组间pRb的表达量也不尽相同，差异有显著性

19、意义（P=0.015）。组间两两比较，B-ALL中pRb的表达量高于AML，但差异无显著性意义（P>0.05）, T-ALL中pRb的表达量高于B-ALL，也高于AML且差异均有显著性意义（P<0.05）。将B-ALL和T-ALL同归类为一类急性淋巴系白血病，比较ALL与AML中间表达量的差异，ALL 22.33 (0.63-74.30) 显著高于AML 12.51(0.25-64.43)（P=0.018）。同时，我们检测到在部分白血病细胞中pRb有缺失表达，缺失表达率分别为： AML 7/25(28%), T-ALL 1/10(10%), B-ALL 6/54(1

20、1%), AML的缺失率明显高于其他型白血病。缺失率的比较用卡方检验，组间比较及两两比较均未发现差异的显著性（P=0.136）(P>0.05)。pRb的表达水平与白血病细胞周期有关视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）是细胞周期的抑制子，为验证pRb的表达是否能够将肿瘤细胞限制在G1期，我们应用流式细胞仪的PI DNA染色法进行了6例不同类型白血病细胞的细胞周期分析。结果发现在所有检测的6例标本中非白血病细胞的细胞周期分析是一致的，但在肿瘤细胞中pRb表达阳性的T-ALL和AML中处于G1期的白血病细胞数高于pRb表达阴性的病例，但差异不明显，而pRb表达阳性的B-ALL处于G1期的白血病

21、细胞数却显著高于pRb表达阴性的病例（92% vs 77%）（图2）。这种差异性可能具有重要基础研究与临床应用意义，值得我们今后分析更多病例，更深入的探讨。Table . Expression of pRb in child acute leukemia（略）pRb与微小残留病监测的相关性对初发患儿标本做pRb表达检测的同时，根据我们以前建立的急性B系淋巴细胞白血病MRD监测的方法，我们对其中的37例标本作了19天及早期缓解后的MRD检测，比较初发病人的pRb表达水平与MRD的关系发现，在B-ALL中MRD阴性组为21例，pRb表达中间值为 22.90 (0.75-92.91)；MRD阳性组为

22、16例，pRb为 9.50 (0.40-44.00) 。MRD阳性组中pRb的表达量明显低于阴性组，且差值有统计学意义（P=0.047）。为验证白血病的治疗过程中pRb表达水平的检测是否具有重复性，我们又对大部分作19天MRD检测的骨髓标本检测其治疗后的pRb表达水平，检测发现在同一患者标本中初发和MRD检测时非白血病细胞中pRb表达水平是稳定（图3）。如图示该病例患儿初发时骨髓中非白血病细胞的pRb表达量为8.03%，做19天MRD检测时骨髓中非白血病细胞的pRb表达量为8.04%。pRb与危险度的相关性分析我们研究pRb与危险度的关系拟分析pRb的表达量是否与白血病的危险度有关联，从而决定

23、是否对于治疗起作用。对46例检测过pRb表达且接受治疗的患儿进行的危险度评价表明：低危组（LR）, 中危组（MR），高危组（HR） pRb的表达量中间值依次为16.46 (0.61-63.52 )， 22.90 (2.04-74.35)， 29.87 (0.44-92.82)。虽然低危组低于中危组、高危组，但统计学三者比较 (P=0.372) 或组间两两比较 (P低中=0.188; P低高=0.770; P中高=0.354) 均未发现差异的显著性。pRb与早期治疗预后的相关性研究在检测pRb表达的41例病人中，我们对其进行了治疗效果的综合评价，判定标准如前。其中预后良好组为24例，pRb 29

24、.75（2.06-72.33）；预后不好组17例，pRb 18.62 (0.40-41.04)。 预后不好组pRb的表达量低于预后良好组，两者比较有显著性差异（P=0.037）。对其进行相关性分析发现，pRb的表达量与治疗预后之间存在一定相关性（r =-0.335, P=0.032）。讨论视网膜母细胞瘤基因 (Rb) 是第一个被克隆成功的肿瘤抑制基因, 其编码的视网膜母细胞瘤蛋白（pRb），既可通过与E2F、Elf-1等转录因子结合成复合物阻止转录因子活化从而控制着细胞的生长和分化, 又可通过调控与细胞增殖有关的原癌基因的功能如c-myc、c-fos等抑制细胞增殖促进细胞分化。Rb基因的异常造

25、成pRb缺失表达或表达异常，细胞失去自身生长负调节能力，导致肿瘤的发生4。自Rb作为抑癌基因克隆成功后，关于其在血液系统肿瘤的异常表达研究表明，Rb的异常表达与白血病的发展及预后有关。Sauerbrey等5研究发现在急性白血病中Rb失活的频率占30%-64%, Rb基因结构异常达18%。在急性髓性白血病中, Rb蛋白缺失占19%-55%。Rb基因的缺失在肿瘤中是一普遍现象，Rb基因缺失的结果是导致pRb蛋白水平的低表达或不表达。在各类急性白血病中我们均检测到有pRb蛋白水平的缺失表达，缺失表达率分别为： AML 28%（7/25）, T-ALL 10%（1/10）, B-ALL 11%（6/5

26、4）。AML的缺失率高于其他型白血病，这与国外报道结果基本一致2。AML与B-ALL，T-ALL缺失率的差异无显著性，说明pRb在各类白血病中的缺失表达具有普遍性。在我们研究的89例新发各类急性白血病中，pRb的平均表达量明显高于正常水平，ALL的表达水平高于AML且有显著性差异。同时发现在多例病人中pRb的表达中间值18.37（0.55-70.37）大大高于正常水平。因为以前的研究表明，pRb的表达与其磷酸化状态以及处于肿瘤特异性的S期肿瘤细胞比例呈正相关6，所以我们发现的各类白血病中高水平表达的pRb可能以磷酸化形式存在。虽然高度表达，但pRb失去活性，释放与之结合的转录因子E2F或暴露其

27、结合位点，促进细胞周期越过G1/S限制点，所以pRb这种形式的高水平表达也可提示肿瘤细胞增殖活跃。在白血病的发生中，可能存在细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖激酶等pRb上游调控因子的异常表达，使pRb高异常表达，高磷酸化。近年来研究发现，pRb影响肿瘤细胞的增殖不仅仅是通过作为细胞周期的调控子发挥重要作用，还可能通过其他作用机制如抑制细胞凋亡等发挥作用7。所以白血病肿瘤细胞中pRb不仅缺失表达可参与肿瘤的发生，pRb的高水平表达可能通过不同的机制如高磷酸化状态，抑制细胞凋亡等导致肿瘤的发生。可见pRb的缺失表达及高水平异常表达均可能参与急性白血病的发生发展。从我们6例pRb不同表达水平的各种急性

28、白血病细胞周期分析中得出，pRb不同表达水平的T-ALL、AML中处于G1期的白血病细胞数差异不大，而B-ALL中pRb表达阳性病例G1期的白血病细胞数却高于pRb表达阴性的病例，这表明pRb在不同类型白血病的发生发展过程中可能发挥着不同的作用，这还有待于我们进一步探讨。我们利用此方法检测得出，在B-ALL疾病诊断时的不同的危险度组中pRb的表达无显著性差异，不能作为判别危险度的一项指标。目前MRD对于急性白血病特别是B-ALL的治疗监测起着重要作用，分析MRD阳性组和阴性组pRb的表达发现MRD阳性组中pRb的表达量显著低于阴性组。并且我们检测的几例缓解后作MRD时的骨髓细胞发现，初发时pR

29、b高表达而治疗后表达明显降低或不再表达，而非白血病细胞pRb的表达量是稳定的。这一现象的具体应用还需进一步临床标本的实验验证，但至少这可提示pRb的表达可以作为一项MRD的检测指标应用于临床的可能性。对一些临床上常用的化疗药物作用机制研究发现，其发挥作用的实质是通过调控pRb网络各组分，使无限增殖的肿瘤细胞细胞周期停止进行或诱导其凋亡8。所以pRb的异常表达可影响化疗药物的作用。以往学者报道，pRb的表达与非霍奇金淋巴瘤、急性粒系白血病等血液系统恶性肿瘤的预后的关系结果不一，并缺少系统的研究pRb表达量与急性B系淋巴细胞白血病预后关系的资料。我们的结果表明，在B-ALL早期治疗反应预后不好组p

30、Rb的表达量低于预后良好组，两者比较有显著性差异。在检测的4例pRb阴性表达的B-ALL患者中有3例预后差（占75%），而正常的预后差的比例占41.5%，说明pRb低表达的患者预后相对较差，所以初诊时检测pRb的表达水平对于判断疗效和预后有一定的意义。综上所述，应用流式细胞术检测儿童急性白血病中pRb的表达研究结果表明，pRb在白血细胞中存在缺失或高度表达等异常形式的表达，可能通过不同的机制在白血病的发病机制中发挥作用，在不同类型的急性白血病细胞中pRb的表达也存在一定差异。而且pRb的表达与MRD检测、早期治疗反应的预后存在相关性，这对于B-ALL的治疗监测及预后评估具有指导意义。【参考文献

31、】 1 Jamal R, Gale RE, Shaun N, et al. The retinoblastoma gene (rb1) in acute myeloid leukaemia analysis of gene rearrangements, protein expression and comparison of disease outcome. Br J Haematol, 1996; 94:342-3512 Korkolopoulou PA, Angelopoulou MK, Kontopidou FN, et al. Retinoblastoma gene product and P21 (WAF1, CIP1) protein expression