龙头鱼中内源性甲醛产生的生物化学机理研究{修}

1、 代 码:研究生学号:上海海洋大学硕士学位论文题、英文题目:食品科羯工程专 业:研究方向: 水产品加工燃孙永姓 名:周德庆研究员指导教师:二?年六月六日圭塑塑鲎奎堂堡主堂垡堡壅删上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明:我恪守学术道德,崇尚严谨学风。所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外,本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名.相舢日期:易/年厂月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校

2、有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。口保密 ,在 年解密后适用本版权书本学位论文属于.不保密日学位论文作者签名:?燧名国埒日期护年月日 日期:刎库月日上海海洋大学硕士学位论文龙头鱼中内源性甲醛产生的生物化学机理的研究:幺:鱼学位论文完成时间:指导教师签字:答辩委员会成员签字:上海海洋大学硕士学位论文龙头鱼中内源性甲醛产生的生物化学机理的研究摘 要甲醛,是一种原生质毒,对人体健康有极大的危害

3、。天然是生物体新陈代谢过程中的一种中间产物,但是含量极低。作为有毒化学物质,我国食品相关法律禁止将添加到食品中。国内外大量研究证明许多水产品中存在内源性,而我国关于水产品中内源性的研究还处于起步阶段,有关其产生机理论述更是鲜有报道,因此,我国目前的水产品中含量标准的制定在科学性和实用性方面都存在较大问题,甚至对有关行业的健康发展产生了负面影响。同时鉴于目前市场上依然存在人为添加的现象,如何分辨水产品中的是人为添加的还是自身产生的,也是摆在质监部门面前的一道亟待解决的难题。本论文的研究目的就是探索内源性产生的机理、影响因素等,以期为水产品中限量标准的制定和完善提供科学依据。在确定龙头鱼能够产生内

4、源性的基础上,本论文进行了一系列实验,得到以下结果:.贮藏过程中龙头鱼样品中和二甲胺,不断增加,证明龙头鱼中内源性的存在;相对于龙头鱼的幽门盲囊、肝脏以及肌肉本身,肾脏更能促进内源性的产生,说明肾脏中的促进和产生的活性成分要高于其他内脏,因此可以选用肾脏作为提取的基质能更容易获得理想的活性成分:.从龙头鱼肾脏中获得的提取物能够分解体外模拟反应体系中的氧化三甲胺.生成和,且在不同条件下生成的和为等物质的量,为辨别市场上水产品中的是人为添加还是自身产生提供了理论依据;.龙头鱼肾脏提取物在反应过程中呈现酶的特性,在不同和温度作用下具有钟形曲线,在蛋白质变性剂作用下失去催化活性;其最适反应条件是,温度

5、为;证明龙头鱼肾脏提取物中的活性物质是一种蛋白质酶或者酶系;龙头鱼肌肉浸出液在肾脏提取物作用下和含量均出现增长,证明龙头鱼肌肉中的成分能够在龙头鱼自身酶的作用下产生内源性;.通过实验发现对龙头鱼肾脏提取物中的存在抑制作用,提示提取物中的是一种或者一类以金属离子为激活剂的酶,这种金属上海海洋大学硕士学位论文离子是;不同浓度的对体系中的和含量影响极大,直至体系中的底物接近完全分解;而、等二价金属阳离子对体系中和反应体系的作用效含量无影响;还原剂抗坏血酸对含有.果与基本一致,提示我们是而不是还原剂本身对和含量有影响;.探索性地测定多种包括含有内源性的水产品样品以及不含有内源性的水产品样品中的总铁含量

6、,发现含有内源性的样品中的总铁含量明显要高于不含有内源性的样品,排除不含有的淡水水产品样品,种海水水产品样品中总铁含量与内源性含量之间存在显著的正相关,进一步提示了在内源性产生之间的密切关系。本论文初步探讨了龙头鱼中内源性产生的生物化学机理和影响因素,为今后水产品中内源性产生机理的进一步研究以及其甲醛限量标准的科学制定奠定了基础。关键词:内源性甲醛, 二甲胺, 龙头鱼, 氧化三甲胺酶, 机理圭塑塑堂奎堂堡主堂垡笙茎一?一一.一. ,. , .,.:. . , ,; , .; . : , ;,;,; . ,嬲;十江计,什;.。 嬲十., , .、, ;, . .,。 ,:上海海洋大学硕士学位论文

7、目录弓 言.水产品中的甲醛?。.的物理化学性质?。.的毒理学性质?.水产品中的来源.在水产品中的存在方式及测定方法。.龙头鱼及龙头鱼内源性研究状况?.龙头鱼简介。.龙头鱼中内源性的研究状况.氧化三甲胺酶?。.水产品中的?.在海洋生物中分布.海洋生物中的生理作用.与代谢相关的酶.内源性氧化三甲胺脱甲基作用?.活性测定方法?。.的纯化?.的鉴定.本论文的研究目的和意义第一章龙头鱼样品在贮藏过程中含量的变化?小?.材料与方法.仪器与设备.材料与试剂.方法.标准储备溶液的标定?.标准储备溶液的标定?.标准曲线的绘制.龙头鱼肌肉样品的制备.龙头鱼肌肉中的测定.龙头鱼肌肉中的测定.数据处理?.结果与讨论.

8、龙头鱼样品在贮藏过程中和含量的变化?.小结第二章龙头鱼肾脏提取物对氧化三甲胺反应体系的作用.材料与方法.仪器与设备?。.材料与试剂?.上海海洋大学硕士学位论文.方法.提取缓冲液的配制?.。. 底物缓冲液的配制.龙头鱼肾脏提取物的制备.龙头鱼肌肉提取液的制备.反应体系.反应体系中和的测定.肌肉提取液与肾脏提取物的反应.肌肉提取液中和的测定?.对肾脏提取物灭活作用.响应面设计和数据处理.结果与讨论.单因素实验以及反应体系中与的含量关系.提取物最适条件的确定.响应模型的分析与验证?.最适条件下肾脏提取物对肌肉浸出液的作用?. 对龙头鱼肾脏提取物的灭活作用。.小结第三章亚铁离子等对肾脏提取物活性的影响

9、.材料与方法?.仪器与设备.材料与试剂.方法?.样品的湿法消化.工作参数以及铁标准曲线.样品水分的测定。.缓冲体系.缓冲体系中和的测定?.结果与讨论“.对反应体系的作用以及金属离子辅因子的确定.和抗坏血酸对反应体系的作用?.水产品中总铁含量与含量的相关性.小结?。结沧.参考文献?致谢?上海海洋大学硕士学位论文引言.水产品中的甲醛水产品一直深受广大消费者喜爱,随着市场经济的迅速发展,人们生活水平的提高以及保健意识的增强,水产品的需求越来越大,要求也越来越高。但是近年来,一些不法经营者为了保持水产品的新鲜外观,延长保存期,增加重量,不顾人民群众的身体健康,用甲醛浸泡处理水产品,造成了水产品不同程度

10、的污染,极大地损害了消费者的利益,严重威胁着广大人民群众的身体健康。但是大量研究和检测结果表明许多水产品中还存在内源性,如鳕形目的多种鳕鱼、鱿鱼以及狗母鱼科的龙头鱼等等。本论文对以龙头鱼为代表的一些水产品中内源性产生的机理,包括生物化学本质,影响因素等进行了初步的探索。.的物理化学性质天然是生物细胞在丝氨酸,甘氨酸,甲硫氨酸以及胆碱代谢的中间产物【】。本身是一种无色的刺激性气体,其水溶液体积比%或者质量比%称为福尔马林,医学上用作防腐剂和消毒剂。的物理化学性质如表.所示:表.的物理化学性质【】. 英文名称化学式 结构简式分子量 ./外观 无色气体自燃点%爆炸极限溶解性 易溶于水沸点 .纯溶液,

11、%溶液熔点 .纯溶液,%上海海洋大学硕士学位论文.的毒理学性质具有原生质毒性,按其毒性分级,属于中等毒性物质,在我国有毒化学品优先控制名单上高居第二位【。对人体的急性毒性主要表现在对上呼吸道,眼睛和皮肤的刺激作用。因为的水溶性极高,在没有到达肺部以前已基本被上呼吸道粘膜吸收,所以吸入性能够引起上呼吸道,主要包括鼻腔,咽,气管和支气管的损伤;眼部暴露于的主要表现是灼热感和流泪;而皮肤直接接触可以引起过敏性皮炎、色斑,甚至坏死。的慢性毒性涉及对免疫、神经系统的影响,遗传生殖毒性和致癌作用也有相关文献报道。淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等可介导生物体内的体液和细胞免疫反应,等人【】将雌性/大鼠暴露于,

12、和浓度下周发现,暴露于下的大鼠体内的巨噬细胞和嗜酸粒细胞比大鼠要明显增多,但是白细胞介素却显著减低;在体外试验中,暴露下脾脏培养液上清液中脂多糖刺激产生的丫干扰素明显下降,而卵清蛋白刺激暴露水平的大鼠中发现抗卵下生成的单核细胞诱导蛋白.显著增加。清蛋白和两种抗体明显下降,而数量没有发现变化。对神经系统有明显的作用。将麻醉的大鼠置于的下暴露.其鼻腭神经对戊醇刺激的反应明显降低,用刺激大鼠鼻粘膜处的三叉神经末梢。可抑制受试大鼠的呼吸率。抑制作用与浓度成正比,这在动物自我保护上有积极意义。但随.浓度的增加易使受刺激神经产生耐受性。三叉神经在的作用天后,可产生持续周的耐现象,而在低于此浓度的作用下则无

13、这种耐受性。研究表明在哺乳动物细胞的体外试验中能表现出遗传毒性【。可以导致动物细胞不同水平上的损伤,如染色体畸变,碱基突变等等,其导致损伤的机理是由于羰基亲电性和较小的空间位阻作用,并可以诱发自由基效应,因而可以攻击核酸和蛋白质等生物大分子而引起一系列反应。王丽等人【】从水平证实了低浓度可以诱导细胞断裂,高浓度则可以诱发交联。生殖毒性的研究主要集中在试验动物上,易建华等人【】通过人工注射方式对小鼠进行暴露,发现高剂量组的小鼠精子数量显著降低,精子活力与畸形率与剂量的关系存在统计学意义。能够引起试验动物发生癌变,有人怀疑白上海海洋大学硕士学位论文血病与有关,北京儿童医院血液病研究中心发现,在我国

14、一些大气污染严重的城市,大约有%的白血病患儿家中短期内装修过房屋;哈尔滨市第一医院血液病研究所也发现多名白血病患儿中,.%的家庭在发病前半年内进行过装修【。但是对人类的致癌作用还没有确切证据。.水产品中的来源马敬军等人【】认为水产品中的的可能来源主要有以下个方面:作为养殖场和一些加工场所设施、工具等消毒作用使用的:以为原料生产的塑料制品在接触食品或水产品而发生的游离的迁移;水产品养殖过程中,作为杀虫渔药使用而造成在鱼体内的残留;为了较长时间保持水产品新鲜外观,延长货架期,增加水产品的持水量而人为地向水产品中添加的;在酶和非酶作用下水产品自身产生的内源性。其中人为添加的和自身产生的内源性是目前水

15、产品中检出的主要原因。.在水产品中的存在方式及测定方法在水产品中的存在方式如图.所示:曲噙甲醛司硅舶甲醪 通迓:澳定臣篝为结台甲醛上海海洋大学硕士学位论文图水产品中存在状态和测定方法【】. 水产品中的游离是指在室温下处于游离态,能够用高氯酸溶液或三氯乙酸溶液提取的一部分;可逆结合是指除去游离,在酸性条件下通过水蒸气蒸馏法能够蒸馏出来的一部分;通过蒸馏法测定的一般要比游离含量大得多,所以可逆结合态在存在本地含量的水产品中占较大部分。考虑到在水产品中和是等量存在的,试验测定的的量要大于,所以水产品中还有一部分不能通过水蒸气蒸馏的方法提取出来,这部分被称为不可逆结合。不可逆结合的不能直接测定,只能通

16、过测定含量而推算出来【。有人认为水产品中游离的含量与水产品对人体毒理学作用相关,而结合的含量则是表征水产品质构变化的重要参数【。检测方法最大的问题出现在样品基质中的提取过程,即前处理中【引,由于能够与鱼肉中的蛋白质、核酸以及许多小分子物质如游离氨基酸,胺类,肌氨酸,核苷酸等发生反应,的高反应活性导致了其添加实验的回收率很低【。提取过程中,游离可以通过以下种方法提取:室温条件下水或者缓冲溶液提取【】:低温条件下酸溶液提取【】;中性或者碱性条件下蒸馏提取【引。结合方面,与鱼肉组织等通过稳定的化学键结合,这些化学键,如在赖氨酸与精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸等氨基酸之间的亚甲基桥,能够在酸性条件下通过高温

17、过程断裂;但是有些亚甲基桥是酸稳定性的,比如赖氨酸与酪氨酸以及其他与甲基基团与赖氨酸之间的亚甲基桥对酸水解作用稳定旧;由于反应的多样性,样品中总含量测定的难度和不确定度都非常高。目前广泛接受的是研究冷冻鳕形目鱼类中总含量的测定方法,即根据对应关系测定以含量推算出含量【引。提取液中的定量方法主要是分光光度法,通过显色产物与吸光值的线性关系对定量,主要分为试剂法和变色酸法。试剂法的原理是乙酰丙酮与在过量铵盐作用生成黄色,.二乙酰基.,.二氢吡啶,在下比色定量:变色酸法是,.二羟基萘.,.二磺酸与反应生成紫色化合物,在处比色定量。.龙头鱼内源性研究状况上海海洋大学硕士学位论文.龙头鱼简介俗称豆腐鱼、

18、九吐鱼、水潺,属于硬骨鱼纲,龙头鱼灯笼鱼目,狗母鱼科,龙头鱼属,是温热带海洋沿岸中小型底栖型肉食性鱼类,在我国黄海、东海、南海均有分布,主要产区集中在浙江和福建沿海,尤以舟山等地最多;主要以小型鱼类及甲壳类为食【。图龙头鱼外形 .?龙头鱼鱼体长形,略侧偏质柔软;头部稍圆,中等大,鼻孔较大,距眼近,眼很小,距吻较近,眼间隔宽,脂眼睑发达;身体呈乳白色,透过皮肤中部轴下肌清晰可见;臀鳍末端到尾鳍之间的尾部两侧有细小圆鳞,侧线鳞.,身体其他部位鳞稀少而近乎裸露,各鳍鳍式为背鳍.,臀鳍.,胸鳍.,腹鳍;背鳍鳍点与腹鳍起点相对:侧线管发达,鳔退化【。龙头鱼水分高达.%,因此肉质细嫩多水,不易贮藏和运输,

19、冷冻对鱼体组织影响明显,一般直接鲜销。龙头鱼中含有丰富的蛋白质、钙、铁、磷等,是良好的蛋白质、钙、铁来源。.龙头鱼中内源性的研究状况由于龙头鱼水分很高而保存期短的特点,在销售过程中常有不法商贩为了延长货架期而向龙头鱼中添加。然而在确定没有人为添加的情况下仍发现龙头鱼中存在,钟惠英等人【对龙头鱼中含量作了较为系统的调查,他们分别从市场、刚靠岸的渔船以及确实未加的张网或丝网渔货物中获取龙头鱼样品,用水蒸气蒸馏.乙酰丙酮分光光度法测定。结果发现龙头鱼死亡后肌体自上海海洋大学硕士学位论文身能产生大量,其含量随鱼体鲜度的下降而升高,但在鱼体高度腐败时急剧下降。鱼体死亡后低温保存.天含量高达?。以上。于.

20、保存天,含量高达?以上。市售干制的龙头鱼不论咸品还是淡品,值高达.?岔,张网获取的样品不去内脏整尾阴干,值高达?。柳淑芳等人【矧也报道了龙头鱼中存在本底含量的现象。.氧化三甲胺酶一些鱼类,包括鳕形目的多种鳕鱼,在冷冻保藏过程中质量稳定性非常差,主要表现在快速的质构改变,导致鱼肉失水发硬。为了解释这一现象研究人员作了大量研究工作。大约多年前有人发现一些鱼类,尤其是冷冻时质量下降的鱼类在冷冻过程中出现和的积累【。日本的一些学者在世纪六七十年代在这方面做了许多工作,他们研究了大量鱼类品种和不同组织,认为和含量最高的组织往往是在内脏。同时他们也发现只要发现有,也会存在。许多试验证明和是等量产生的并且由

21、存在于生物体内能够分解氧化三甲胺的一种酶催化产生】。还有一些人认为在鳕鱼冷冻过程中有可能存在非酶作用的降解,这一降解过程由存在于肌肉中的小分子物质如/,半胱氨酸或者牛磺酸【,或者其他化合物如主要存在于红肉,血液或者其他含有高含量血液成分的组织中的血红素蛋白【】引起。以上温度下降解的非酶作用机制中发现通过和半胱氨酸作用有三甲胺产生。这一领域的其他学者认为冷冻条件下鳕鱼中产生的和大部分是由于一种酶或者酶系的作用而产生的。通过向鳕科和非鳕科鱼类的白肉中添加具有高活性的组织通过冷冻储藏都能够使其产生,而其他如来自非鳕科鱼类血液或者肾脏等没有活性但含有大量血红素蛋白的组织却不能在冷冻过程中分解产生和,这

22、也证明了降解的酶学本质。同时催化反应进行的化合物的热稳定性和高分子量特性也进一步说明了此过程的酶学机制捌。在无脊椎动物,如鱿鱼 中发现有非酶机制的降解,在加工蒸煮过程中有大量,和产生。许多综述文献中汇总了关于冷藏过程中不同鱼类酶促降解以及其对食品质量影响的著作【。上海海洋大学硕士学位论文.水产品中的. 在海洋生物中分布物理化学性质见表.不仅是保持鱼类和甲壳类生理功能的重要化合物同时还是导致生鲜和加工水产品变质的关键物质。尽管一般来说鱼类主要通过捕食小型甲壳动物和软体动物来获得,但鱼类本身具有内源性合成的能力【,十足目动物中含量丰富;甲壳类中此类化合物含量也相当可观;而牡蛎,贻贝和蛤蜊中只检测到

23、少量的。许多综述中汇总和讨论了大量水生动物组织中含量【】。表.总结了南极地区鱼类,深海鳕科硬骨鱼,淡水硬骨鱼类和其他鱼类含量。表 的物理化学性质.性质分子量:.:.氧化还原电势:.眦厂偏摩尔体积:.密度 .,溶液表水生动物中的:. 种类和组织含量?湿重软体动物章鱼,肌肉.鱿鱼,肌肉板鳃类.鳐,肌肉.鲨,肌肉.甲壳类,肌肉硬骨鱼类北大西洋鳕科,白肉或鱼片上海海洋大学硕士学位论文鲆鲽类,白肉红鲇 ,白肉,鱼片鲱侈体鲐鱼 ,鱼片南极水域南极鳕鱼,鱼片巧饥鳄冰鱼,鱼片 北太平洋狭鳕 白肉跖肝脏幽门盲囊胆囊肠体铝脾深海鳕形目硬骨鱼细鳞拟深海鳕肌肉组织液长尾鳕科肌肉组织液淡水鱼类尼罗尖吻鲈 鱼片药罗非鱼,

24、鱼片鱼类中含量可能因饵料等原因而不同,同时受鱼龄,鱼体大小以及所处环境盐分,温度和压力【影响。板鳃类软骨鱼和深海硬骨鱼的肌肉中含量最高,达到?湿重。其他海洋硬骨鱼类的含量在到?湿重之间。除了极少数种类夕,淡水水产品中不含有或者含量很少。不同组织中分布情况以阿拉斯加绿鳕数据为例在表.中作了描述。与早期研究结果相反,鱼类血液中也发现有。作为季节性如水温变化上海海洋大学硕士学位论文血清中含量对含量影响的例子,亚洲胡瓜鱼在到之间,变化较大。具有冬季适应性的太平洋鲱 ,海公鱼 和白点六线鱼其血清中的浓度在到之间。白肉鱼,包括大西洋鳕 和红鱼由 ,浅色肉中的含量要比暗色肉大的多,而红肉鱼的情况恰恰相反【。

25、脑部白质含量为通过核磁共振检测发现角鲨?湿重,灰质中为?,而体壁中为?。】。总之,海洋鱼类各组织中均发现有不同含量的,有些淡水鱼类中也发现有。.海洋生物中的生理作用渗透压调节有充分证据证明鱼类中的具有调节渗透压的功能。比目鱼肌肉中的含量随和三刺鱼着其从海水环境到淡水环境的转换而下斟。同样的现象也出现在盲鳗,当将盲鳗置于不同渗透压的海水中时,其肌肉中的含量与环境渗透压大小呈线性相关【。深海鳕科硬骨鱼类肌肉中的含量也与血清渗透能力成线性关系。最后,板鳃类鱼类中的高含量可以解释为对鱼体的渗透保护,作为渗透物具有对尿素的抵消作用【鲫。浮力调节有人通过测定其肌肉组织液和血浆中,其他代谢物以及无机离子的偏

26、摩尔体积研究了其对板鳃类浮力调节作用【。通过计算和尿素对黑鲸鲨 浮力的贡献,作者认为和尿素对软骨鱼类浮力调节有正效应。作为尿素拮抗剂人们在研究板鳃类中高浓度的生理功能时发现和其他甲基胺类与尿素之间的抵消作用。能够稳定高浓度尿素条件下酶的动力学特性,维持蛋白质构象【】。上海海洋大学硕士学位论文海洋板鳃类包括鲨鱼和鳐鱼等鱼类肌肉中和尿素的摩尔比大约为:。在这一比例下板鳃类和非板鳃类中的酶得以保持其活性。的这一保护机制通过物理化学手段研究认为尿素和与蛋白质之间存在热力学代偿机制。对蛋白质高压变性的保护作用深海硬骨鱼类肌肉中高含量的说明可能对静水压对细胞蛋白质的脱稳作用有抵抗作用【。有人从.深海中生活

27、的鱼类白肉中分离纯化了乳酸脱氢酶,研究了和静水压对 的作用,发现高浓度的存在能够降低高压力导致的值上升。更能说明问题的是.等人】的报道,他们发现贝加尔湖中淡水片脚类动物体内的含量随着压力的增大而大量增加。这充分说明了压力与含量的关系。.与代谢相关的酶三甲胺单加氧酶三甲胺单加氧酶催化从合成过程的反应,反应式如下:矿?此酶存在于甲基营养型细菌【,桡足类哲水蚤目动物以及一些海洋鱼类中】。从海洋桡足类哲水蚤部分纯化出了三甲胺单加氧酶【。以及两种南极研究发现鲱鱼 、胡瓜鱼鱼类肝脏中显著的单加氧酶活性与这几种鱼类血清中的水平有明显的相关性。抑制剂研究表明催化的合成的是含有黄素而不是细胞色素的单加氧酶。.三

28、甲胺脱氢酶脱氢酶催化的氧化脱甲基作用,产物为和,反应式如下:一此酶存在于兼性甲基营养型细菌中【】,以一种黄素蛋白为电子受体。脱氢酶含有一个.簇和共价结合的黄素。鱼类腐败茵中没有发现脱氢酶【】,冷藏鱼类中的和含量在其深度腐败阶段时含量很低。产阈值。在西瓦氏菌属外周胞质组分中发现了两种还原酶,纯化的酶分子量为,为一种钼酶。大部分与鱼类腐败相关的肠杆菌,交替单胞菌属,发光杆菌属和弧菌属的细菌都能够在厌氧生长过程中以作为最终电子受体而使之还原。因此含量是作为表征水产品腐败程度的重要参数。.氧化三甲胺脱甲基酶通过脱甲基作用生成和的反应过程如反应式所示:许多鳕科鱼类中都发现了这一重要内源性反应,其与冷冻储

29、藏过程中品质劣化直接相关。.内源性氧化三甲胺脱甲基作用影响嗄脱甲基酶分布的因素关于鱼类死后产生的催化反应是否也能在活体中进行,到目前为止还没有文献报道。此酶或者此类酶的纯化工作需要进一步开展。尽管在所有海洋鱼类和无脊椎动物以及部分淡水鱼类中均有分布,但目前确定的仅有特定种类的海洋动物具有活性】。当然,在海洋和淡水生物中真正的分布情况不为人知,因为目前不同作者研究的对象基本上都是具有商业价值的种类。检测到和积累的鱼类主要隶属于鳕科,无须鳕科和蛇鼻鱼科【。鳕形目是具有的代表性鱼类。同时非鳕形目鱼类的活性水平要明显低于鳕形目。无脊椎动物中存在的令人费解,尽管这类生物中存在和,但是好像仅有内脏中含有成

30、分。鲆鲽类,红鲇中没有发现存在活性,鲱类除了在大西洋鲱肾脏中发现活性之外,上海海洋大学硕士学位论文其他鲱鱼也没有活性。脱甲基酶的生物化学本质在某一特定的物种和组织中,水平有着较大的变异系数【。诸如性别,成熟阶段,所处环境温度,饵料情况以及体型大小等因素能够直接影响到活性。有人观察到夏季捕捉到的处于产卵期的大型银无须鳕,其活性是冬季捕获的非产卵期的小型鱼的两倍。有人对活体中此反应的底物提出疑问。如综述前面所述在鱼类等的生理方面有多种功能和作用,但是不同鱼体组织和器官中水平与存在降解的酶之间的联系并没有明确。因此有人认为在活体中并不具有脱甲基作用【】。和】认为酶促降解可能与发生在活体内的脱甲基作用

31、相关,并且与异源化合物的脱毒作用有关。这些反应被认为是发生在肝脏中的微粒膜上。与之相关的酶被认为是电子传递组分如黄素蛋白和细胞色素的复合物。有人研究了在解剖学上的分布情况。其中以内脏,肌肉和皮肤中的活性最高,内脏中的含量比肌肉中的耐】。红肉通常比白肉的含量高,在一些红肉含量比较高的种类,如金枪鱼和鲭鱼中,低温储藏过程中仅红肉中的出现增长【。鳕科鱼类中也有此现象【。通过测定活性证明大多数鳕形目鱼类的肾脾等内脏活性最高,其他内脏和体液如幽门盲囊和血液活性居中,其余的如肝脏和肌肉中协活性较低【。根据的分布情况,其活性成分在一些可溶性组分或者内脏和组织的匀浆中被分离出来。】等人从狗母鱼 的肝脏中分离出

32、一种,他发现部分纯化的可溶性经过碱处理可以分为可溶性和不可溶性组分,且只有这些组分的混合物才具有脱甲基活性。肌肉中存在的酶类。他们发现等人【研究了红鳕可溶性组分和肌肉匀浆中均有存在,并对不可溶性成分进行了深入而广泛的研究。和和及等人【分别发现两种鳕鱼肾脏中分别有%,.%的活性来自非可溶性部分。等人【】发现 和,妇留凇肾脏和脾脏中上海海洋大学硕士学位论文%活性来自不可溶组分。在分离纯化和定性等方面,由于具有较高的活性,很大一部分工作集中在了从内脏提取的不可溶部分.。但也有部分研究关注肌肉方面的. 活性测定方法活性的测定方法主要是通过在一定时间内测定转化为和的的量来确定的。目前文献中已有几种测定方

33、法,这些方法的主要区别在于测定时使用的辅因子种类的不同,其他区别包括酶孵育过程中是否存在氧气,测定的产物的不同以及测定过程中的激活剂的不同。氧气对反应过程的影响争议较大。一般来说有两种方法去除体系中的氧气:第一种是抽真空】;第二种是使用葡萄糖和葡萄糖氧化酶,通过催化作用清除体系中的氧气【舢。部分研究人员在测定过程中没有除去氧气【¨。在活性测定方法中应用的辅因子种类较多。一些学者使用,半胱氨酸和抗坏血酸【】以及加入还原性亚甲基蓝【并排除氧气。这一测定方法相对来说比没有加入还原剂的方法更灵敏。等人使用了另外一种不加入人工电子供体如亚甲基蓝的测定方法。由于加入或者能够提高活性,他们认为黄素

34、核苷酸是的辅因子。这类辅因子包括黄素核黄素,和。反应通过加入三氯乙酸等蛋白质变性剂终.,经离心等操作去除沉淀部分,测定上清液中的产物。测定反应产物的方法也有不同。的测定方法比要来得简单,所以一般来说的测定是最基本的。可以通过比色法阴或者关联脱氢酶法测定。测定方法也是比色法,但是操作要繁琐得多蚓。.的纯化尽管属于膜蛋白,的纯化方法与水溶性蛋白的纯化方法基本类似。膜蛋白属于两亲性物质,需要提供其环境类似物以保持其活性。特定的蛋白质/脂类/去污剂比例在整个纯化过程中是非常必要的。如果比例改变可能会对蛋白质的功能和性质产生影响【】。膜的制备方面,亚细胞结构细胞器的膜可能是不溶性存在位置,上海海洋大学硕

35、士学位论文但是目前并没有研究证实哪种细胞器与活性相关。有的研究认为其与溶酶体膜有关【引。也有入认为存在于肌肉微粒体膜上【。通过加入缓冲溶液进行高速匀浆,再通过离心去除可溶性蛋白质,这一过程可作为粗分离而为进一步提取做准备。在不同去污剂的作用下结果各不相同。微粒体对各种去污剂均有抵抗作用。.和脱氧胆酸盐既不会影响活性也不能使之洗脱下来,相比而言十二烷基磺酸钠则有效得多【。和】使用 . 和将洗脱下来,他们发现去除 会导致的沉淀现象;和玳【】使用.%浓度的 .从鱼类组织中提取了;等人【】使用获得了,且活性有所提高。色谱分离方面,目前使用不同的色谱层析技术已实现了对可溶性的分离。等人【】从去污剂萃取的

36、膜组分中利用阴离子交换层析技术分离出种组分,他们以的.缓冲液平衡.柱,三种组分分别在.,.和. 强度下洗脱。作者也因此认为是一个多酶体系。其中一个组分.的活性是上柱的部分纯化提取物的.倍,是粗提液活性的倍,产率为.%。.的鉴定由于在纯化过程中存在的问题,活性的鉴定比较困难,对反应过程中辅因子的研究能让我们比较好的理解这一反应。研究发现催化降解作用需要一种可透析的辅因子【引。在早期即报道了辅因子的本质特性,他认为存在于海洋生物内脏中的热稳定性辅因子对从狗母鱼肝脏分离出的是必须的,同时他也报道还原态的或,黄素以及柠檬酸能够提高的活性。其他一些物质也能改变的活性。它们之中有些物质如谷胱甘肽、抗坏血酸

37、,黄素,血红蛋白,肌红蛋白和亚甲基蓝能够提高的活性防】。其他物质如碘乙酰胺,氰化物和叠氮化物能够抑制的活性。表.中列举了能够激活或者抑制活性的一些化合物。大多数作者都报道过核营酸尤其是黄素类核苷酸作为激活剂的现象。其他如亚甲基蓝或者吩嗪硫酸甲酯等含有异咯嗪结构的化合物均是强激活剌】。上海海洋大学硕士学位论文表影响活性的物质【】. 试剂 辅因子 激活剂 无影响 抑制剂核苷酸 核黄素金属矿¨氨基酸半胱氨酸牛磺酸亚牛磺酸其他亚甲基蓝甲萘醌吩嗪硫酸甲酯上海海洋大学硕士学位论文至少有两套生理辅因子系统与有关:一套由和核黄素组成,其中黄素是必不可少的;另外一套系统由,抗坏血酸或者半胱氨酸组成】。

38、第一套系统需要厌氧条件【,而第二套系统不受氧气影响【】。也有研究认为氧气能够抑制第二套系统的活性【。有人认为降解为和反应的速率限制因素为辅因子的浓度。向肌肉中添加能够分解或者抗坏血酸等已知辅因子的化合物能够降低冻藏期内和的产生速率。在金属离子中,仅发现具有激活作用,而其他二价阳离子对反应无影响。其他离子如在浓度下对反应具有抑制作用,或者在较低浓度下对反应无影响【。的抑制剂种类也很多。这些化合物中大部分同时也是氧化还原反应的抑制剂,属于强氧化剂,如。氧气或氧化剂的存在能够抑制冷冻红鳕中的酶促降解【,。叠氮化物和氰化物能够抑制,可能与脱甲基相关的与肌肉微粒体相关的血红蛋白在厌氧条件下并不能被叠氮化

39、物所还原【¨。脱甲基作用能够被与氧化还原反应有关的化合物所抑制或激活的事实证明催化的反应存在与氧化还原酶有关的电子传递机制。同时该反应很有可能存在几个阶段,因为有许多化合物都具有抑制作用【】。研究发现在特定的组分中分离的,其活性受到脂类尤其是磷脂的影响。等人【朗分离并分析了这类磷脂组分,发现不同的磷脂/蛋白质比例能够解释分离组分不同的层析特性。不同组分中的磷脂组成并不相同,一些组分中为极性磷脂。不过这些磷脂似乎对活性并无影响,因为经过不同磷脂酶的消化作用并未观察到活性的改变。上海海洋大学硕士学位论文脂类和其他相关蛋白质的存在可能会影响到表观分子量的大小。所以有的文献中记录的非常大的分

40、子量并不一定可靠。等人【趵】给出的数值就在之间。的另一个特性就是其稳定性。尽管存在热变性作用,但是此酶的变性的温度下限似乎非常低,因为实验证明在冷冻储藏的低温下此酶仍具有活性。有文献认为在.下仍具有活性,但随着温度的下降酶活性也随之下降】。以实验室鱼肉体系和部分纯化提取物体系都研究了的热变性作用。不同的鱼类结果各不相同。阿拉斯加绿鳕在冷冻前在预加热在星期内能够减少%的生成量。如果温度为就能完全抑制和的产生【明。但是与处理对银鳕完全没有作用,只有在才能完全抑制和的产生。也许由于不同的试验条件的原因,提取物的变性试验结果也各不相同。处理即能使从红鳕肌肉微粒体中使用提取的%的活性丧失。而完整的的微粒

41、体组分对热具有更强的抵抗作用】。从绿鳕幽门盲囊中提取的含有的丙酮粉,在.。处理即丧失全部活性陋】。体外反应的最适基本在.左右【,%。也有学者发现的最适为中性。活性中心:等人【】在对绿鳕骨骼肌中的进行生化鉴定的过程忠克隆出一组含量极高的蛋白质。其中一种以标示的编码一组由个氨基酸组成的含量极高的蛋白质,此蛋白质经和个氨基酸,间修饰作用后转化为,成熟的/含有其中个;另一个以标示的在端与有着相同的核苷酸序列,其编码的蛋白质具有一个额外的多聚片段和一个富含的端,端富含片段的氨基酸序列与哺乳动物中的富组氨酸的结合蛋白具有高度同源性。和的在骨骼肌中含量最丰富,在肾脏等器官中也能检测到较低浓度的。人工合成的聚

42、合体在的存在下具有显著的催化活性,而单体和寡聚体没有活性。纯化的和可能与催化活性有关的结合能力较低。最后作者认为鱼体死后在肌肉中形成的多聚.复合物可能与贮藏过程中的产生有关系。动力学特性:部分纯化的的动力学特性研究表明的降解反上海海洋大学硕士学位论文应遵循米氏方程。试验测定的的值自.不等【.。如此低的说明白肉中并不是其降解反应的限速因子,因为鳕形目白肉中的含量远高于值【捌。电泳特性:和鼹】研究了的电泳分离。他们将从凝胶过滤柱得到的高分子量的冻干粉,通过非筛选性琼脂糖基质经未变性电泳分离得到了了两条带,一条迁移率高另一条非常低,两条带经活性染色均呈阳性。当分离基质成分改变时.%琼脂糖,%丙烯酰胺

43、分离得到条带,两条高迁移率的带呈现较强的活性染色特性。.本论文的研究目的和意义近年来,作为影响水产品质量和安全的主要问题之一,一直是社会关注的焦点,各地纷纷要求阐明产生机理,提出限量标准,加强水产品中的健监控。国外在引起的内源性积累的研究方面已经开展了许多的研究工作,但是其机理和的特性还有许多方面未明了,国内在这方面的研究多集中于含量的动态研究,有关其产生机理论述却鲜有报道,因此目前我国水产品中含量标准的制定在科学性和实用性方面都存在较大问题,制约了有关行业的发展。同时鉴于目前市场上依然存在人为添加的现象,如何分辨水产品中的是人为添加的还是自身产生的,成为摆在质监部门面前的一道亟待解决的难题。

44、我国是水产大国,水产品在我国国民经济和日常生活中占有很重要的地位,水产品内源性危害是质量安全一个不容忽视的问题,制定科学合理的限量标准不仅关系到人民群众的身体健康,更关系到一些行业的健康发展。凯氏定氮仪:电子分析天平:;.数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;型控温电热套:鄄城华鲁电热仪器有限公司:.水浴恒温震荡器:金坛精达仪器制造厂;.快速混匀器:金坛市金城国胜实验仪器厂;.全自动鼓风干燥箱:上海智城分析仪器制造有限公司;.箱式电阻炉马弗炉:上海跃进医疗器械厂;.低速离心机:雷勃尔;冰柜:澳柯玛。.材料与试剂磷酸溶液:取磷酸,加入蒸馏水,混合均匀;乙酰丙酮溶液:称取乙酸铵,溶于蒸馏水中,

45、加入冰乙酸和乙酰丙酮.,混匀,贮存于棕色试剂瓶中,在.冰箱内可保存一个月;.?。碘溶液:称取碘化钾晶体,溶于水中,加入.碘,待碘完全溶解后,加水定容至,移入棕色瓶试剂中,暗处贮存;?以氢氧化钠溶液;硫酸溶液:取硫酸,加入蒸馏水,混合均匀;.。硫代硫酸钠标准溶液:按厂 .中规定的方法标定;.%淀粉溶液:此溶液应现用现配;标准储备液:吸取.含量为.%溶液于容量瓶中,加水稀释至刻度,为标准储备液,冷藏保存周;标准溶液?以:根据标准储备液的浓度,精密吸取适量于上海海洋大学硕士学位论文容量瓶中,有水定容志刻度,适.标准溶液浓度为?,混合均匀,此溶液应于实验当日配制;盐酸标准储备液:称取干燥盐酸晶体.,用

46、蒸馏水定容至;盐酸标准溶液:根据盐酸标准储备液的浓度,精确吸取适量于;容量瓶中,使标准溶液工%氯乙酸溶液:称取三氯乙酸溶于蒸馏水;铜铵试剂:称取乙酸铵,硫酸铜晶体.溶于蒸馏水,加入氢氧溶于蒸馏水,再加入浓氨水,定容至; 化钠无水硫酸钠:将硫酸钠于马弗炉中脱水;二硫化碳.甲苯溶液%:吸取 与经过重蒸脱水的甲苯混匀;%醋酸溶液;龙头鱼:购自舟山市渔港,渔船靠岸龙头鱼后直接加冰封箱运至实验室处理。.方法.标准储备溶液的标定精密吸取制备的标准储备液.,置于碘量瓶中,加入. .?碘溶液,.氢氧化钠溶液,放置 再加入.硫酸溶液,放置用浓度为.?.的硫代硫酸钠标准溶液滴定,当滴定至淡黄色时,即如. .%淀粉

47、指示剂,继续滴定至蓝色消失,记录所用硫代硫酸钠溶液体积。同时用蒸馏水作空白滴定,记录空白滴定所用的硫代硫酸钠溶液的体积。标准储备液的浓度以式计算:五:?.式中:?标准储备液中的浓度,单位为毫克每升?。;空白滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,单位为毫升;一滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,单位为毫升:硫代硫酸钠标准溶液的物质的量浓度,单位为摩尔每升?.;一 ?.碘相当于的质量,单位为毫克;所用标准储备溶液的体积,单位为毫升。.标准储备溶液的标定上海海洋大学硕士学位论文精密吸取制备的标准储备液.于消化管中,加入催化剂消?,.化片,. 和. 再加入.的浓硫酸,静置放冷,置于 凯氏定氮仪中开始消解,测

48、定样品的含氮量。.标准曲线的绘制标准曲线的绘制精密吸取/的标准溶液、.、.、.、.、.于纳氏比色管中,以蒸馏水补齐至.加入乙酰丙酮溶液,涡旋震荡混合均匀,置于沸水浴中加热,取出用流水冷却至室温;以空白液为参比,于波长处,以比色皿进行比色,测定吸光度,绘制标准曲线。拿望. . . . .图 标准曲线.?标准曲线的绘制精密吸取含有?以的标准溶液、.、.、.、.、.于纳氏比色管中,以蒸馏水补齐.,加入铜铵试剂,精确移取.甲苯溶液,于水浴中保温,涡旋震荡使溶液充分反应,加入醋酸溶液,涡旋震荡直至溶液甲苯层澄清,静置,取甲苯层,以无水硫酸钠脱水,于波长处比色,绘制标准曲线。上海海洋大学硕士学位论文.翟.

49、望专口. 图 标准曲线.?.龙头鱼肌肉样品的制备将龙头鱼去皮去头,小心取肌肉,避免弄破内脏造成污染。以解剖剪分别取龙头鱼肝脏、幽门盲囊和肾脏,按照:比例添加这三种内脏到肌肉中;用组织捣碎机捣碎并混合均匀,以肌肉作为空白对照,共得到种样品;混合均匀后的组织以为一份分装到碎料白封袋中,于冰箱中贮藏个月,期间测定肌肉中和含量变化。.龙头鱼肌肉中的测定龙头鱼样品中的游离的测定取样品.于具塞三角瓶中加入%溶液,振摇使样品在溶液中均匀分散,静置,之后将浸提液在条件下离心,取上清液于纳氏比色管中,加入乙酰丙酮试剂于沸水浴中加热,取出后于流水中冷却至室温,在处进行比色,同时做空白对照。根据标准曲线计算样品中的含量。龙头鱼样品中可逆结合的测定游离含量按式计算,计算结果保留两位小数,五兰×.%式中:卜浸提液总体积,单位为。可逆结合的测定取样品.样品于圆底烧瓶中,加入蒸馏水,用玻璃棒搅拌均匀,盖紧玻璃塞浸泡,加入磷酸溶液后立即接入蒸馏装置进行水蒸气蒸馏,接收管出口事先插入盛有蒸馏水且置于冰水浴的容量瓶中,同时做空白对照。吸取蒸馏液于纳氏比色管中,加入乙酰丙酮试剂于沸水浴中加热,取出后于流水中冷却至室温,在波长处进行比色,根据标