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文档简介

1、考马斯亮蓝 G-250 (Coomassie brilliant blue G-250)法测定蛋白质含量考马斯亮蓝 G- 250 (Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该法是 1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为01 000 w JmL, 是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。关键词:马斯亮蓝测定考马斯亮蓝 G-250CoomassiebrilliantblueG-250蛋白质含量一、目的学习和掌握考马斯亮蓝 G-250测定

2、蛋白质含量的原理和方法。二、原理考马斯亮蓝 G- 250 (Coomassie brilliant blue G-250 )测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm ;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质- 色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含 量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结 合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试 剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测

3、定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为 01 000 w ”mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。二、材料、主要仪器和试剂1 .实验材料新鲜绿豆芽2 .主要仪器(1)分析天平、台式天平(2)刻度吸管(3)具塞试管、试管架(4)研钵(5)离心机、离心管(6)烧杯、量筒(7)微量取样器(8)分光光度计3.试剂(1)牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取100mg牛血清白蛋 白,溶于100mL蒸储水中,即为1 000wg/mL的原液。(2)蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250 ,溶于50mL90 %乙醇中,加入85% (W/V)的磷酸100mL , 最后用蒸储水

4、定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。(3)乙醇(4)磷酸(85%)四、操作步骤1 .标准曲线制作(1) 0100wg/mL标准曲线的制作:取6支10mL干净的具塞试 管,按表1取样。盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置 2 min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色,记录各管测定 的光密度OD595nm ,并做标准曲线。表1低浓度标准曲线制作(2)01 000wg/mL标准曲线的制作:另取6支10mL具塞试管,按表2取样。其余步骤同(1)操作,做出蛋白质浓度为01 000区 g/mL的标准曲线。表2高浓度标准曲线制作2 .样品提取液中蛋白质浓度的测定(1)待测样品制备

5、:称取新鲜绿豆芽下胚轴 2g放入研钵中,加2 mL蒸储水研磨成匀浆,转移到 离心管中,再用6mL蒸储水分次洗 涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置 0.51h以充分提取,然 后在4 000r/min离心20min,弃去沉淀,上清液转入10mL容量瓶, 并以蒸储水定容至刻度,即得待测样品提取液 。(2)测定:另取2支10mL具塞试管,按下表取样。吸取提取液0. 1mL (做一重复),放入具塞刻度试管中,加入 5mL考马斯亮蓝G -250蛋白试剂,充分混合,放置 2min后用1cm光径比色杯在59 5nm下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X (小力以标准曲线1号试管做空白五、结果计算式中:X为在标准曲线上查得的蛋白质含量(六、附注1 . Bradford法由于染色方法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现 已广泛应用于蛋白质含量的测定。2 .有些阳离子,如 K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定,但大量的去污剂如 TritonX-100、SDS等严重干扰测定

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