计算机虚拟筛选技术的应用---高原舒复方产品的研制

1、计算机虚拟筛选技术的应用一 “高原舒”复方产品的研制作者:日期:计算机虚拟筛选技术的应用-'高原舒”复方产品的研制王丽君，金玲玲，姬迎春，李建银，杨永建（兰州大学药学院 生药学研究所，甘肃 兰州73000 ） 摘要：目的：采用计算机软件模拟系统，通过计算机模拟进行分子对 接，探究“高原舒颗粒”（选用柳茶为君药，黄苣、当归为臣药）的效用 物质基础。根据文献资料查阅已知25种柳茶成分，58种黄苣主成分 和62种当归主成分三维结构，并根据其功能相关性，模拟复方单味药主成 分与一氧化氮合酶受体的相互作用，筛选出与一氧化氮结合的可逆能力， 运用计算机模拟筛选药物组方原理，利用天然药物资源，开发出

2、能够缓解 高原反应症状、抗缺氧、抗疲劳的同时又能提高机体免疫力、补气活血等 保健功能的中藏药现代制剂。方法：根据计算机模拟复方单味药主成分效 用为参考，设计单味药提取条件和工艺，将柳茶、当归、黄苣分别用不同 有机溶剂回流提取，再用旋转蒸发仪回收浓缩的方法获取浸膏；之后以已 发表论文配比为基础，按一定的剂型处方配取药液，制备缺氧性小鼠模型， 通过灌胃给药方式治疗。将小鼠随机分为模型对照组、柳茶提取物组、黄 苣提取物组、当归提取物组，复方混合提取物组、同时设空白对照；除空 白对照组外，各组灌胃给药，基础饲料喂养，连续给药7天，通过一定的方法处理后观察小鼠的抗缺氧能力。结果：模型小鼠的抗缺氧能力高。

3、结 论：高原舒具有缓解高原反应症状和抗缺氧、抗疲劳的作用。关键词：柳茶；高原病；抗缺氧1材料与仪器1.1 药材 柳茶采自甘肃省甘南藏族自治州的合作市郊，为蔷薇科鲜卑花属植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata（Rehd.）Hand.-Mazz. 的叶；当归 采自甘肃省岷县，为伞形科植物当归的根；黄苣采自甘肃省岷县，为豆科 植物膜荚黄苣的干燥根，以上药材均经兰州大学药学院杨永建教授鉴定。1.2 仪器旋转蒸发仪RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂；SHB-HI型循环水式 多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；电子天平，梅特勒-托利及（常州）称重设备系统有限公司；手提式多功能粉碎机，上海广沙工

4、贸有限公 司；电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司。1.3 试剂分析纯无水乙醇，批号20120301,天津市光复科发展有限公司； 分析纯石油醍，天津市光复科发展有限公司；甲醇，色谱纯试剂，天津市 光复精细化工研究所；分析纯乙酸乙酯，天津市光复科发展有限公司；分析纯三氯甲烷，天津市白世化工有限公司；分析纯正丁醇，莱阳化工实验 厂；蒸储水，兰州大学 GLP实验室。2方法2.1 药物的提取与分离2.1.1 柳茶.取粗枝叶粉碎，共1088g。依次用石油醍，EtOAc和EtOH八倍量 回流提取，每次3h,分别抽滤回收溶剂，得各部浸膏 38.7g,86.2g,73.9g 。2.1.2 黄苣干燥黄苣粉碎

5、，共499g。乙醇回流提取3次，每次6倍乙醇提取 2h,抽滤合并提取液，回收溶剂得浸膏 127.6g,加6倍水稍加热使之 悬浮。分别以石油醍、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇 2倍量各4次萃取， 回收溶剂得各部浸膏10g,2.5g,6.5g,8.1g。2.1.3 当归当归生药粉碎，共319g。分别用8倍量70狮酉1、30卿醇和水， 回流提取3h,抽滤回收溶剂。得各部浸膏164.7g, 44.9g, 26.5g。2.2 动物实验2.2.1 实验小鼠的喂养分组取健康成年昆明鼠48只，雌雄各半。随机分为6组，每组4只 雌鼠4只雄鼠，分装在各笼中。第一组蒸储水（0.2ml/10g ）,第二 组柳茶浸膏混合溶液（

6、0.2ml/10g相当于原药材0.366g/10g ）,第 三组当归浸膏混合溶液（0.2ml/10g相当于原药材0.108/10g ）, 第四组黄苣浸膏混合溶液（0.2ml/10g相当于原药材0.222/10g ）, 第五组柳茶黄苣当归浸膏 2 : 0.5 : 1混合溶液（0.2ml/10g相当于原药材柳茶0.076g黄苣0.063g当归0.009g/10g ）第六组柳茶黄 苣当归浸膏1 : 0.1 : 0.5混合溶液（0.2ml/10g相当于原药材柳茶0.040g黄苣0.013g当归0.005g/10g ）。每日上午喂食喂水控制 体重，晚上灌胃给药。2.2.2 小鼠抗缺氧检测给药一周，观察记

7、录小鼠行为、体重、饮食等。末次给药前禁食不 禁水12小时，给药后45分钟分别封装在广口瓶中，记录各小鼠死亡 时间。2.2.3 . 3数据处理采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，结果用又s表示，组 间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01具有显 著统计学意义。3实验结果3.1 计算机模拟分子对接结果与NO合酶对接较好的成分柳茶鲜卑花酯-14.5126正二十四烷十八酸二十醇咖啡酸酸-12.771-12.5869-12.5713-12.5538黄芭韦蕊异黄酮-7-O- f3 -D2 ', 4'-二甲氧半乳糖醛酸山奈酚-7-O-葡7-羟基-3 &

8、#39;, 4 '葡萄糖甘-17.3421基.3 '-羟-15.7238萄 糖 昔二甲氧基-2',基.异黄烷-15.42135-一葡萄糖异-6-0-13-葡萄黄 烷 昔W -16.5519-15.0359当归肉豆寇酸-14.3427胱氨酸蔗糖谷氨酸邻苯二甲酸-13.5605-13.5217-13.327-13.17933.2 动物行为学观察试验期间，大鼠毛色光滑，进食量稳定，与正常组相比活动增加3.3 各药物提取液对小鼠抗缺氧时间的影响表1-1各药物提取液对小鼠抗缺氧时间的影响（x s）N/min1空白组527.4600 ± 1.479192柳茶提取物混合组6

9、aaa43.8333 ± 5.988883当归提取物混合组8bbb31.2500 ± 2.817804黄芭提取物混合组8aac39.9625 ± 5.150855柳茶：黄芭：当归 =2:0.5:1639.6167 ± 10.40662 aac6柳茶：黄黄：当归 =1:0.1:0.57aaacc41.3286 ± 9.13906与空白组作比较，a:P<0.05,aa:P<0.01,aaa:P<0.001;与柳茶组做比较b :P<0.05,bb:P<0.01,bbb:P<0.001;与当归组做比较，c :P<

10、;0.05,cc:P<0.01,ccc:P<0.001;与黄茜组做比较，d :P<0.05,dd:P<0.01,ddd:P<0.001;与混合组 2:0.5:1 作比较，e :P<0.05,ee:P<0.0,eee:P<0.0011;与混合组 1:0.1:0.5 作比较，f :P<0.05,ff:P<0.01,fff:P<0.001 。结果表明，柳茶组，黄苣组，柳茶：黄苣：当归 =2:0.5:1组，柳茶： 黄苣：当归=1:0.1:0.5组相对于空白组都可明显提高小鼠抗缺氧的时间，增强小鼠耐氧能力。柳茶组，黄苣组，柳茶：黄苣：当归

11、 =2:0.5:1组，柳 茶：黄苣：当归=1:0.1:0.5组相对于当归组都有不同程度的提高。30.00-20.00-M |lIII1234561厘门纨2柳茶提取物混介机打提取物混合料14黄花 贸取物海合纲5柳茶.四花工当归=2:0518柳茶：黄茂工 rPl= 1:0,1:0.5w.oo-40.00-B显小均值图1-1各组抗缺氧时间4讨论体内一氧化氮（NO）主要通过激活可溶性鸟甘酸环化酶（GC）,使 靶细胞内cGM咏平升高而发挥生理作用。内皮型一氧化氮合酶（eNOS） 产生的NO可扩张血管、调节血压、改变局部血流、抑制血小板聚集、抗 平滑肌细胞增殖。神经型一氧化氮合酶（nNOS）产生的NO以递

12、质形式参 与神经信息传导和内分泌调节。诱导型一氧化氮合酶（iNOS产生的NO在 炎症、免疫反应中起细胞毒与细胞抑制作用。本实验通过计算机模拟个 药物成分与NOS勺结合能力，研究结合能力较强的药物成分对小鼠抗缺氧、 抗疲劳能力的影响。25种柳茶成分，58种黄苣主成分和62种当归主成分三维结构模拟复 方单味药主成分与一氧化氮合酶受体的相互作用结果表明，各药物中与NO合酶结合能力较强的成分与各所含主要成分相一致，说明是各药物的主要 成分在起作用。上述药物的提取方法即提取各药物的重要成分。柳茶组，黄苣组，柳茶：黄苣：当归=2:0,5:1组，柳茶：黄苣：当归 =1:0,1:0,5 组相对于空白组都可明显

13、（P<0.01）提高小鼠抗缺氧的时间， 增强小鼠耐氧能力，说明这几组药物的配比都有缓解高原反应的能力。柳 茶组，黄苣组，柳茶：黄苣：当归=2:0.5:1组，柳茶：黄苣：当归=1:0,1:0.5组相对于当归组都有不同程度的提高，说明当归中含有抗缺氧的成分物质 含量较低。柳茶：黄苣：当归=2:0,5:1组可显著(P<0.01)提高小鼠抗缺 氧能力，柳茶：黄苣：当归=1：0.1：0.5 可极显著(P<0.001)提高小鼠抗 缺氧能力，说明后者“君臣佐使”原则的药物配比效果较好。但相对于柳 茶组没有明显的提高，有待进一步研究探索出更好的药物配比，使其更加 完善。总之，柳茶，黄苣具有较好的缓解缺氧的能力，柳茶、黄苣、当归不 同的配比对抗缺氧，缓解高原反应都具有一定的意义。但本实验仅是对上 述药物抗缺氧、缓解高原反应的初步研究，还需要对其进行细胞及分子水 平的证实，探讨其作用机制，从而为更好的开发高原草药资源，找到更好 的缓解高原反应的药物打下基础。参考文献：1中华本草 苗药卷，贵州科技出版社，2005年ISBN:7806623O5 编委【2】张承忠，