高效液相色检验方法验证方案

1、型高效液相色谱仪测定川葛含量检验法验证案文件编号 S-YF-013 (01)起草人英南 日期2012年08月26日审核人 日期2012年08月31日批准人立新 日期2012年08月31日生效日期 2012年09月01日专业资料验证项目申请单文件编号：SMP.QA-YG-001-01再确认项目用高效液相色谱仪测定川茸含量检验法验证目的对已进行设计、选型、安装、运行及系统适应性测试设备确认的 高效液相色谱仪，通过选用生产品种（药典）川茸进行含量测定， 验证具检验法准确度、精密度、专属性、线性、围、耐用性的正 确性，证实该设备设计、选型是否符合药品质量标准中含量测定 的要求，使检验指标具后可控性、科

2、学性、准确性，使设备达到 设计要求及规定的技术指标，把好质量关，使合格产品能按GMP 要求进行放行。小 组成 员组长：组员：要求完成时间2012年09月09日提出部门：质量保证部批准部门：冉确认委员会签字年月日签字年月日备注验证项目计划书文件编号：SMP.QA-YG-001-02验证题目用高效液相色谱仪测定川茸含量检验法验证目的概要对已进行设计、选型、安装、运行及系统适应性测试设备确认的高效液相色谱仪，通过选用生产品种（药典）川茸进行含量测定，验证具检验法准确度、精密度、专属性、线性、围、耐用性的正确性，证实该设备设计、选型是否 符合药品质量标准中含量测定的要求，使检验指标具后可 控性、科学性

3、、准确性，使设备达到设计要求及规定的技 术指标，把好质量关，使合格产品能按 GMP要求进行放 行。再确认小组成员组长：组员：验证法用高效液相色谱仪测定含量检验期待结果用已确认的设备对生产品种进行含量测定，验证检验法的准确度、精密性等符合生产、质量、GMP的规定，符合该 设备的设计、选型能够满足检验要求，所采用的法达到相 应的检测要求，达到测得指标的科学、准确性，已满足控 制产品质量的需要。验证式同步验证超过允值的对应措施1 .待系统稳定后，重新检测。2 .必要时，对肩关设备重新处理和调整后，再测试，分析 检测结果以确定/、合格原因。3 .若属于设备运行面的原因，必要时报再确认委员会，调整设备运

4、行参数。验证实施时间2012年09月01日小组负责人2012年08月31日起草责任者起草时间2012 #：08月26日审核责任者审核时间2012 彳尹08月31日批准责任者批准时间2012 彳尹08月31日验证案审批表吉SMP.QA-YG-001-03再确认案名称用高效液相色谱仪测定川茸含量检验法验证再确认案编号S-YF-013 (01)起草人英南2012年08月26日审核人所在部门签字审核意见日期质量管理部三月 日生产技术部4三月 日设备动力部4三月 日饮片车间4三月 日供销部4三月 日化验室4三月 日4三月 日岑月月日岑月月日岑月月日岑月月日岑月月日岑月月日批准人日期年 月日批准意见同意执

5、行日期年 月日目录1再确认目的2再确认围3再确认责任4容4.1 概述4.2 再确认容4.2.1 再确认小组4.2.2 预确认4.2.3 安装确认4.2.4 运行确认4.2.5 性能确认4.2.6 结果分析与评价4.2.7 再确认期文件名称用图效液相色谱仪测定J1茸含量检验法验证文件编号S-YF-013- (01)起草人英南起草日期2012年08月26日审核人审核日期年 月 日批准人批准日期年 月 日执行日期年 月 日颁发部门质量管理部版本号01分发号分发部门质管化验车间办公销分发数量21110011目的确认经设备确认高效液相，按药典检验法测定生产品种含量，验证 其检验结果科学性、准确性、精密性

6、等，满足检验结果正确性需要，有 效控制产品质量。提供必要的文件以证实本设备的操作与所预期的完全一致。根据本案的验证，确认按检验操作规程操作，能有效的保持本设备 于确认状态下，能稳定地、恒定地达成其所预期的功能。围质量标准、检验操作规程文件的汇集。验证设备用于含量测定检验法的准确性在标准围验证设备用于含量测定检验法的精密度可靠性验证设备用于含量测定检验法，在设计的围，测试结果与供试品中被测物尝试直接呈正比关系的程度。验证设备用于含量测定检验法具有专属性。验证设备用于含量测定检验法在达到一定精密度、 准确度和线性时，其测定值高低限在可控围。验证设备用于含量测定检验法的耐用性。责任质量管理部负责验证

7、案的起草，申请审批，验证过程的监督、资料的存档，再确认案的执行及再确认结果的评估。化验室负责实验的操作，原始记录、报告的填写。验证小组负责验证报告的审核。容1 概述：本设备由 P3000 高压输液泵和 UV3000 可变波长紫外/可见分光检测器组成。P3000高压输液泵是以CPLD技术为核心，由单片机控制的高精密 输液泵系统。它基于全数字的频率发生系统、先进的马达驱动系统及友 好的人机显示页面似的该设备的操作及控制很便。先进的泵头及单项阀 设计思路，融汇了当今世界上最先进的经验，使得用户在各种使用条件 下都可以保证输液的精度及重复性指标。UV3000 紫外 / 可见波长检测器是完整的高效液相色

8、谱仪的一个重要的组成部分。该检测器的设计以当今最先进的技术为先导，通过数字化的数据处理和控制，其基线噪声和漂移降低到一个新的极限。由于采用了数字量输出功能，该检测器可以与计算机直接通过串行口相连而不需要任数据采集单元。该设备已经设计、安装、运行、性能确认，并经过计量校验，在有效期围。通过该设备用于生产品种川芎中阿酸的含量测定，验证该设备 的准确性、精密性、专属性、线性、围、及耐用性是否符合要求。2 验证容2.1 验证小组： 由厂验证领导小组安排， 成立 P3000/U3000 高效液相色谱仪验证小组。2.1.1 组长：杰2.1.2组员:小组职务姓名所在部门职务组员设备动力部设备管理员组员化验室

9、主任组员质量管理部质量监督员组员化验室化验员2.2 预确认2.2.1 设备基本情况2.2.1.1 设备制造商及零件供应商资料设备名称：高效液相色谱仪编 号: 型 号:制造商: 地 址: 电 话:传 真: 联络人:2.2.2设备的档案资料文件名称存放地点高效液相色谱仪质量管理部一份产品保修单质量管理部一份使用证明书质量管理部一份合格证质量管理部一份设备开箱验收单质量管理部一份设备安装调试验收单质量管理部一份综合性评价结果上述设备档案材料符合 GMP和生产工艺要求。检查人检查日期年 月日复核人复核日期年 月日色谱工作站质量管理部一份2.3该设备是否满足GMP及现行生产工艺要求的确认2.3.1 检查

10、并确认设备组成的单体结构应完整，并且各单体结构外观应无缺陷性损坏。设备单体结构名称有无缺陷损坏可变波长紫外/可见分光检测器无缺陷损坏身压输液泉无缺陷损坏综合性 评价结果设备组成的单体结构完整，并且各单体结构外观无缺陷性 损坏。检查人检查日期年 月日复核人复核日期年 月日2.3.2检查设备所有材质制造应符合生产工艺要求单体设备名称要求材质实际材质可变波长紫外/可见分光检测器不与药物发生化学反应不锈钢身压输液泉不与药物发生化学反应不锈钢综合性评 价结果设备所有材质制造不与药物发生化学反应，符合药 品检验要求。检查人检查日期年 月日复核人复核日期年 月日2.4设备确认该设备已经设备的设计、安装、运行

11、、性能再确认，同时该设备经 计量校验确认，并在有效期围。56%2.5人员、环境、试药的确认化验员已经均经过培训，熟悉法及使用的仪器，环境湿度为温度为 20 均在合理围。对照品从生物检定研究院购置， 批号为有效期为其它试剂为色谱纯，水为纯化水均符合试验要求。3 含量测定3.1 准确度验证准确度系指用该法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（ % ）表示，准确度应在规定的围测试。3.1.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1%醋酸溶液（30 ： 70）为流动相；检测波长为 321nm。理论板数按阿酸峰计算应不低于 4000 。 流速： 1.0ml/m

12、in ；色谱柱规格： 4.6x 250mm ;粒度：5 Mm；进样量：10册3.1.2 对照品溶液的制备取阿酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml含20 wg的溶液，即得。3.1.3 供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0. 5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70% 甲醇 50ml ，密塞，称定重量，加热回流 30 分钟，放冷，再称定重量，用 70% 甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。3.1.4 测定法 可用上述已知纯度的对照品做加样回收测定，即于已知被测成分对照品，在规定围，取同一浓度的供试品进行测定。分别精密吸取对照品溶液与

13、供试品溶液各10区1,注入液相色谱仪，测定。同一浓度， 用 6 个测定结果进行评价， 应报告已知加入量的回收率（ % ） ，或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差（ RSD% ） 。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。公式：回收率 = (C-A) /B*100%式中A为供试品所含被测成分量；B为加入对照量；C为实测值。实测值公式：平均值X= EXi/n平均偏差=E I Xi-X | /n平均相对偏差=平均偏差/平均值附图：样品与对照品峰面积见图谱。加样回收率考察取本品粉末6份，精密称定，按照供试品法制备，得到供试品溶液 各50ml ,各加入10ml对照品溶液，摇匀，

14、得到待测溶液，滤过，进样, 计算峰面积，得到数据如下表：注意：在加样回收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成 分含有量之和必须在标准曲线性围之；加入的对照品的量要适当，过小 则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。表1含量测定川茸加样回收率试验表序 号样品称量 (g)样品阿琳的 同(mg)对照品 加入量 (mg)实测值 (mg)回收率 (%)回率的 平均值 (%)RSD(%)10.50140.55150.20.7534100.95100.080.891320.52260.67940.20.878699.6030.51730.62080.20.819399.2540.526

15、60.63190.20.8348101.4550.53250.69230.20.889799.7060.51480.61780.20.816999.55检测人：检测日期：结果评价：检查人：复核人： 日期： 年 月 日3.2 精密度验证精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样 测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差，标准偏差或相对标 准偏差表示。同一浓度，用6个测定结果进行评价。精密度包含重复性，中间精密度和重现性，其中重现性是在不同化 验室不同时间进行实验，查看实验结果有没有重现性，本公司只一个实 验室此项略。3.2.1 重复性（设操作人员A）在相同操作条件下，由同一个

16、分析人员在较短的间隔时间测定所得 结果的精密度称为重复性；3.2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂；以甲醇-1%醋酸溶液（ 30: 70）为流动相；检测波长为321nm。 理论板数按阿酸峰计算应不低于 4000。流速：1.0ml/min ;色谱柱规格: 4.6X250mm ;粒度：5即；进样量：10人3.2.1.2 对照品溶液的制备取阿酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml含20 pg的溶液，即得。3.2.1.3 供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0. 5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70%甲醇50ml ,密塞，称定重量

17、， 加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量， 摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。3.2.1.4 含量测定A 25 f -Wt3.2.1.5 计算A n含量(mg / g) f T WT式中f为对照品的浓度除以对照品峰面积得到的值的平均值;AT为对照品峰面积；单位 Msec ;nT为供试品的稀释倍数;WT为供试品的称量；单位g3.2.1.6 将计算的结果填入下表表2含量测定阿酸重复性试验表在舁 厅P样品称量（g）含量(g/g)含量的平均值（g/g）RSD (%)10.50140.100.121670.619120.52260.1330.51730.1240.5

18、2660.1250.53250.1360.51480.12检测人：检测日期:结果评价:检查人:复核人:日期:3.2.2 中间精密度（换一时间，换一操作人员，设操作人员为B）在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度称为中间精密度；同一浓度，用 6个测定结果进行评价。3.2.2.1 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为 填充剂；以甲醇-1%醋酸溶液（30: 70）为流动相；检测波长为321nm理论板数按阿酸峰计算应不低于 4000 。流速：1.0ml/min ;色谱柱规格: 4.6X250mm ;粒度：5即；进样量：10人3.2.2.2 对照品溶液的制备取阿

19、酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml含20 pg的溶液，即得。3.2.2.3 供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0. 5g ,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70%甲醇50ml ,密塞，称定重量， 加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量， 摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。3.2.2.4 含量测定3.2.2.5 计算公式：含量(mg / g)f AT nTWTAt 25 f TWT式中f为对照品的浓度除以对照品峰面积得到的值的平均值;AT为对照品峰面积；单位 w*sec ;nT为供试品的稀释倍数；WT为供试品的称量；单位g

20、表3:含量测定阿酸甲中间精密度试验表在舁 厅P样品称量（g）含量(g/g)含量的平均值（g/g）RSD (%)操作员A10.50140.11980.12000.007420.50140.120330.50140.119640.50140.121150.50140.118660.50140.12070.12510.0255操作员B10.51730.120620.51730.125930.51730.123740.51730.130150.51730.123860.51730.1263检测人：检测日期：结果评价：检查人：复核人：日期： 年 月 日3.3 线性及线性围线性系指在设计的围，测试结果与供

21、试品中被测物尝试直接呈正比 关系的程度。应在规定的围测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样， 制备一系列供试品的法进行测定， 至少制备 5 个浓度的供应品，以测得的响应信号作为被测物尝试的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。数据要求：应列出回归程，相关系数和线性图。围系指能达到一定精密度、准确度和线性、测试法适用的高低限尝试或量的区间。围应根据分析法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。3.3.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1%醋酸溶液（30 ： 70）为流动相；

22、检测波长为 321nm。理论板数按阿酸峰计算应不低于 4000 。 流速： 1.0ml/min ； 色谱柱规格：4.6X250mm ;粒度：5即；进样量：10人3.3.2 对照品溶液的制备取阿酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml含20 wg的溶液，即得。3.3.3 供试品溶液的制备取本品粉末 （过四号筛） 约 0. 5g ， 精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70% 甲醇 50ml ，密塞，称定重量，加热回流 30 分钟，放冷，再称定重量，用 70% 甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。3.3.4 含量测定3.3.5 计算公式：含量(mg

23、 / g)WTA 25f -WT式中f为对照品的浓度除以对照品峰面积得到的值的平均值;AT为对照品峰面积；单位 Msec ;nT为供试品的稀释倍数；WT为供试品的称量；单位go表4川茸阿酸不同浓度的峰面积浓度（mg/ml ）0.0050.010.030.050.07峰面积（w*se©回归程y=29433200x相关系数R2=0.9999检测人：检测日期：结果评价：检查人：复核人：日期： 年 月 日3.4 耐用性耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使法用于常规检验提供依据。开始研究分析法时，就应考虑其耐 用性。液相色谱法中典型的变动因素有：不同厂牌或批号的色

24、谱柱、固 定相，不同类型的担体，柱温，进样口和检测器温度等。经试验，应说 明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保法有效。本试验以流动相的组成比例、同一规格的色谱柱为变动因素，得出 测定结果不受影响的程度，为使法用于常规检验提供依据。3.4.1 对照品溶液的制备取阿酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml含20 pg的溶液，即得。3.4.2 供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约0. 5g ,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 70%甲醇50ml ,密塞，称定重量， 加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用 70%甲醇补足减失的重量， 摇匀，静置，取上清液，滤过，取

25、续滤液，即得。3.4.3 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；1、以甲醇-1%醋酸溶液（30: 70）为流动相；检测波长为321nm。 理论板数按阿酸峰计算应不低于 4000。流速：1.0ml/min ;色谱柱规格： 4.6X250mm ;粒度：5即；进样量：10人2、以甲醇-1%醋酸溶液（ 35: 65）为流动相；检测波长为321nm。 色谱柱规格：4.6 x 250mm ;粒度：5即；进样量：10注。3.4.4 测定将数据整理，填入下表。表4含量测定耐用性试验表保留时间分离度理论板数色谱条件1色谱条件2(1)检测人：检测日期：结果评价：检查人：复核人：日期： 年 月 日3.5 专属性专属性是指在其他