实验二__蛋白质的颜色反应

1、实验二实验二 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应 一一 实验目的实验目的 1. 1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。接方式。 2.2.了解蛋白质的颜色反应原理。了解蛋白质的颜色反应原理。 3.3.学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。实验原理(一一) ) 双缩脲反应双缩脲反应 1 1 原理原理 尿素加热至尿素加热至180180左右生成双缩脲并放出一分子氨。左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与双缩脲在碱性环境中能与cucu2+2+结合生成紫红色化合物，此反应结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。称为双缩

2、脲反应。 蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 ( (二二) ) 茚三酮反应茚三酮反应 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。质。

3、该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成COCO2 2、NHNH3 3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。色物质。COCOCOHOH+CCOOHHNH2RCOCOCHOH+RC HONH3CO2+加热加热COCOCHOH+COCOCCOCOCO+2NH3NH2COCOCN+2H

4、2O （三）黄色反应（三）黄色反应 在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸( (如酪氨酸，色如酪氨酸，色氨酸等氨酸等) )残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物，残基上的苯环经硝酸作用可生成黄色的硝基化合物，在碱性条件下生成物可转变为深橙色的的硝醌衍生物，反应在碱性条件下生成物可转变为深橙色的的硝醌衍生物，反应为：为： OH+HNO3HONO2+H2OHONO2+NaOHONOHOH 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸后才能够

5、发生黄色反应。量浓硫酸后才能够发生黄色反应。 ( (四四) )考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250具有红色和蓝色两种色调。在具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋白质通过疏水作用结合后变成蓝色。白质通过疏水作用结合后变成蓝色。 它染色灵敏度高。反应速度快，约在它染色灵敏度高。反应速度快，约在2 2分钟左分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。 在在0.01-1.0 mg0.01-1.0 mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与蛋白质范围内，蛋白质浓度与A A59

6、5595nmnm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。实验试剂实验试剂v1 1 蛋白质溶液；蛋白质溶液；v2 0.12 0.1茚三酮水溶液；茚三酮水溶液；v3 3 浓硝酸；浓硝酸；v4 10%NaOH4 10%NaOH溶液；溶液；v5 5 尿素；尿素；v6 16 1硫酸铜溶液；硫酸铜溶液；v7 0.07 0.01 1考马斯亮蓝染液考马斯亮蓝染液实验操作实验操作（1 1）取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素）取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出

7、氨，形成双缩脲。冷后，加形成双缩脲。冷后，加1010氢氧化钠溶液约氢氧化钠溶液约1 1毫升，振荡混毫升，振荡混匀，再加匀，再加1 1硫酸铜溶液硫酸铜溶液1 1滴，再振荡。观察出现的粉红颜滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。色。 （2 2）向另一试管加卵清蛋白溶液约）向另一试管加卵清蛋白溶液约1010滴和滴和1010氢氧化钠溶氢氧化钠溶液约液约1010滴，摇匀，再加滴，摇匀，再加1 1硫酸铜溶液硫酸铜溶液2 2滴，随加随摇，观滴，随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。察紫玫瑰色的出现。 (3) (3) 取试管取试管1 1支，加入蛋白质溶液支，加入蛋白质溶液1ml1ml，然后各加入，然后各加入0.10.1茚三酮水溶液茚三酮水溶液2 2滴，混匀后于沸水浴中加热滴，混匀后于沸水浴中加热1-21-2分钟，观察颜色由有粉色变紫红色再变蓝。分钟，观察颜色由有粉色变紫红色再变蓝。 (4) (4) 于一试管内，置蛋白质溶液于一试管内，置蛋白质溶液1010滴，浓硝酸滴，浓硝酸3-43-4滴，加热，冷却后于室温下逐滴加入滴，加热，冷却后于室温下逐滴加入10%NaOH10%NaOH溶液溶液5 5滴，滴，观察颜色变化。观察颜色变化。 (5) (5) 操作方法操作方法管号管号蛋白质溶液蛋白质溶液（mlml） 蒸馏水蒸馏水（mlml） 考马斯亮蓝考马斯亮蓝染液染液（滴