分解纤维素的微生物的分离

1、专题二 课题3：分解纤维素的微生物的分离一、基础知识 纤维素与纤维素酶1.纤维素（1）单位： 。 （2）形成方式： ，要脱下 。（3）本质：一种由 首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。（4）存在：植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中 是自然界中纤维素含量最高的天然产物。（5）含量：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。（6）作用：组成细胞壁，作植物的骨架。2.纤维素酶 纤维素酶是一种 ，一般认为它至少包括 组分，即 (外切酶)、 (内切酶)和 ，前两种酶使纤维素分解成纤维

2、，第三种酶将纤维二糖分解成 。思考1：草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？ 答：肠胃中的 微生物。能产生纤维素酶而分解纤维素。 纤维素酶的作用对照实验试管甲乙滤纸条1cm x 6cm1cm x 6cm缓冲液10ml11ml纤维素酶/1ml振动1h1h现象分解不分解 1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25，其他反应条件，如pH等均为最适的情况下，在1min内转化1mmol的底物所需的酶量。思考2：乙试管的滤纸条为什么会消失？ 答：本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操作方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否

3、则会影响溶液的pH。（二）纤维素分解菌的筛选1、刚果红染色法（1）刚果红（ ）能的作用 是一种 ，与纤维素形成 复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（2） 染色原理 当在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成 。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的 ，可通过是否产生透明圈来筛选 。 例3：纤维素分解菌的筛选方法？透明圈越大，纤维素分解菌越多？ 答： 。二、实验设计思考4：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？ 答：课题2是将土样成的菌悬液直接涂布在以尿素为 氮源的选择性培养基上，直接分

4、离得到菌落。 本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。1、土壤取样 分布环境：富含 的环境中。 原因：在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高 实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等思考5：为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？ 答：生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境思考6：如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？ 答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实

5、际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约 cm左右的土壤中， 天后可用。2、选择培养 目的： ，确保从样品中分离所需微生物培养基组成提供主要的营养物质纤维素粉 5g碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO4·7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 ·7H2O 0.5g无机盐酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源水解酵素 0.5g氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至1000mL水 制备选择培养基思考7：旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？ 答：是 培养基，原因是配方中无 。思考8：这个培养基对微生物是

6、否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？ 答：有 作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解 的微生物可以大量繁殖。思考9：你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 答：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。说明：该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。 操作方法： 将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。思考10：为

7、什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 答：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。3. 刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。 方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。 方法二：在 时就加入刚果红。思考12：这两种方法各有哪些优点与不足？方法一：方法二：步骤培养基经涂布培养先长出菌落再覆盖1mg/mL的CR溶液(1015min后)倒去CR溶液加入1mol/L的NaCl溶液15min后倒掉NaCl溶液出现透明圈配置10mg/mL的CR溶液灭菌按照1mLCR溶液/20

8、0mL培养基的比例混匀倒平板接种后培养出现透明圈优点显示出的颜色基本上是纤维素分解菌的作用操作简便，不存在菌落的混杂问题缺点操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能产生假阳性反应。有些微生物具有降解色素的能力，他们在培养过程中也会形成明显的透明圈，与纤维素的分解菌不易区分。思考13：方法一中NaCl溶液的作用？ 答： 作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。4.梯度稀释 将选择培养后的培养基进行等比稀释 倍。 器具：移液管、酒精灯、试管、棉花塞 灭菌：试管口和移液管在离火焰 cm。 注意：每次用移液管吸取1ml培养液时，要吹吸三

9、次，使菌液与水充分 。5.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（1）制备鉴别培养基鉴别纤维素分解菌的培养基培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na (水溶性羧甲基纤维素钠)5-10g碳源酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐土豆汁 100mL碳源、生长因子琼脂 15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容1000mL氢元素、氧元素（2）涂布平板： 将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30倒置培养。（3） 挑选产生透明圈的菌落分解尿素的细菌与纤维素分解菌的鉴定培养的比较项目分解尿素的细菌纤维素分解菌培养原理将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上类型

10、目的鉴定原理细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈现象观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌方法6、纯化培养 在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的 上，在300C 370C培养，可获得纯化培养5、 课题延伸 本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的

11、实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。1、为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 实验，纤维素酶的发酵方法有 发酵和 发酵。2、纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 含量进行定量测定。例1：有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究，人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题。 (1) 培养基中加入的化合物A是_，为微生物的生长提供_，这种培养基属于_培养基。 (2) 为筛选出能产生纤维素酶的

12、微生物，向培养基中加入_ _。 (3) 在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前，可用液体培养基培养，增加微生物的浓度。若要获得纯净的菌株，常采用 的方法进行接种，此过程所用的接种工具是接种环，操作时采用_灭菌的方法；还可用 方法接种。 （4）实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是_。1下列材料中纤维素含量最高的是( ) A杨树 B小麦 C玉米 D棉花2纤维素酶能够分解（ ） A纤维素的微生物 B淀粉的微生物 C纤维素 D淀粉3刚果红能与哪项物质形成红色复合物( ) A纤维二糖 B纤维素 C葡萄糖 D麦芽糖4寻找纤维素分解菌应到（ ） A湿润的环境中 B富含纤维素的环境中

13、 C富含无机盐的环境中 D池塘中5纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有( )ANaNO。 BKCl C酵母膏 D纤维素粉6下列哪种生物能产生纤维素酶( )A纤维素分解菌 B牛 c羊 D兔7选择培养时应将锥形瓶固定在( )A桌子上 B温箱里 C窗台上 D摇床8选择培养的结果：培养液变（ ） A清澈 B浑浊 C红色 D产生透明圈9刚果红染色时，加入刚果红可在( ) 制备培养基时 梯度稀释时 倒平板时 涂布时 培养基上长出菌落时 A B C D10两种刚果红染色法的结果是（ ） A均会出现透明圈 B均不会出现透明圈 C方法一出现方法二不出现 D方法一不出现方法二出现11下列生物能分解纤

14、维素的是( ) 人 兔 牛 蘑菇 纤维杆菌 A B C D12纤维素酶可以将下列哪种物质分解( ) A牛肉片 B鱼片C滤纸条 D塑料条13下列不属于纤维素酶组分的是( ) AC1酶 BCx酶C葡萄糖苷酶 D半乳糖苷酶14纤维素酶发挥作用的最适pH是( ) A2.0 B4.8 C6.8 D7.815刚果红能与下列哪种物质形成红色复合物( ) A葡萄糖 B纤维二糖C麦芽糖 D纤维素16从土壤中分离获得某种微生物的步骤是( ) 土壤取样 梯度稀释 选择培养 涂布培养 筛选菌株 A B C D17纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于有( ) ANaNO3 BKClC酵母膏 D纤维素粉18分离土

15、壤中纤维素分解菌所用到的方法是( ) 稀释倒平板法 涂布平板法 单细胞挑取法 选择培养基分离 A B C D 19分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是( ) A经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 B富集培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少 C经稀释培养后，用刚果红染色 D对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上20纤维素、纤维素酶和控制纤维素酶合成的物质，它们的基本组成单位依次是( ) A葡萄糖、葡萄糖和氨基酸 B葡萄糖、氨基酸和核苷酸 C氨基酸、氨基酸和核苷酸 D淀粉、蛋白质和核酸21下列有关分解纤维素微生物的分离的叙述，不正确的是( ) A纤维素酶的发酵方法

16、有液体发酵和固体发酵 B对分解纤维素的微生物进行了初步筛选后，无需再进行其他实验 C纤维素酶的测定方法，一般是对所产生的葡萄糖进行定量的测定 D纤维素酶是一种复合酶22在对纤维素分解菌进行选择培养时用液体培养基的目的是（ ） A用液体培养基可获得大量菌体 B纤维素分解菌适宜在液体培养基上生长 C用液体培养基可以充分利用培养基中营养物质 D用液体培养基可获得高纯度的纤维素分解菌23在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前一般先进行选择培养，其主要目的是( ) A完全除去其他微生物 B没有意义，去掉这一步更好 C增加纤维素分解菌的浓度 D使纤维素分解菌充分长大24纤维素酶在植物细胞工程方面有

17、着广泛的应用，你认为在下列哪种生物体中提取纤维素酶比较合理( ) A发酵酵母 B在腐木上生长的霉菌 C高等植物细胞 D白蚁体内的鞭毛虫21纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括 种组分，即 、 和 。22当纤维素被 分解后，刚果红一纤维素自合物就无法形成，培养基中会出现以 为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生 来筛选纤维素分解菌。23为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维分解菌?24请分析下面的培养基配方，回答下面的问题： 纤维素分解菌的选择培养基 纤维素粉 5 g NaN03 1 g Na2HP04·7H 20 1.2 g KH2P04 0.9 g MgS04·7

18、H 20 0.5 g KCl 0.5 g 酵母膏 0.5 g 水解酪素 0.5 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000 mL (1)上述配方是液体培养基还是固体培养基?为什么? (2)这个培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有，又是如何选择的? (3)如果要证明该培养基的选择培养作用可用培养基做实验。25.请你设计实验来证明纤维素酶的作用。实验步骤：(1)取2支20mL的试管,分别放入1cm×6cm的。 (2)再分别加入pH为4.8，物质的量浓度为0.1 mol·L-1的缓冲液10mL、11mL。 (3)在加入lOmL缓冲液的试管中加入1mL。(4) 将2支试管固定在摇床上，振荡反应1。 结果：加纤维素酶的滤纸条被分解，另一支中的未分解。则证明： 。 1-5：DCBBD 6-10：