聚乙二醇化壳聚糖的合成-开题报告

1、聚乙二醇化壳聚糖的合成（开题报告） 8聚乙二醇化壳聚糖制备、评价及应用的研究摘要：壳聚糖(Cs)具有良好的抗病毒性、组织黏附性、生物相容性和生物可降解性等，在生物医学领域具有广阔的应用前景。CS不溶于水和一般的有机溶剂，因此，对CS进行化学接枝改性是CS研究中的一个重要课题。而聚乙二醇(PEG)化壳聚糖是一类新型功能性聚合物，较未修饰的壳聚糖而言，PEG化壳聚糖在水溶液和有机溶剂中的溶解性均明提高，同时聚合物的细胞毒性降低，生物相容性得以改善。关键词：壳聚糖，接枝共聚物，聚乙二醇1研究背景壳聚糖是一种重要的生物功能性材料，然而由于其分子结构结晶性较高，不溶于一般的有机溶剂和水，极大地限制了其应

2、用1。对壳聚糖进行化学改性，既可以改善壳聚糖的水溶性，又能赋予壳聚糖一些新的性能，常见方法有酰化、羧甲基化、巯基化、季胺化以及聚乙二醇(PEG)接枝等。Harris等2于1984年首先采用还原氨基化反应将PEG醛接枝到壳聚糖上的氨基，合成了PEG壳聚糖接枝共聚物。因在壳聚糖中引入亲水性的基团，破坏了壳聚糖分子链排列的规整性，削弱了壳聚糖分子链间的氢键作用，从而使溶解性能得到改善。近年来随着国内外对PEG化壳聚糖的研究逐渐深人，发现PEG修饰不仅能提高壳聚糖的溶解性，而且还可以改善壳聚糖以及壳聚糖衍生物的细胞毒性，从而使聚合物的生物相容性增加，促进了PEG化壳聚糖在多肽药物、基因药物传输以及生物

3、功能材料上的应用。将PEG链引入壳聚糖分子结构，不仅增加其亲水性，还降低了结晶性，使其在两相中的性能都得到改善。Jeong等3制备了PEG-g-壳聚糖，并用紫外分光光度计法测定了壳聚糖，多种相对分子质量PEG-g-壳聚糖在不同pH值水溶液和不同有机溶剂中的溶解性能。结果表明，壳聚糖溶液在pH为6.0时开始出现混浊；当pH值升至7.4时，则完全析出，且不溶于DMSO、二甲基酰胺、乙醇等有机溶剂。而PEG-g-壳聚糖在pH为4.011.0时均可溶解，而且在DMSO、二甲基酰胺中也有良好的溶解性。Mao等制备的PEG-g-N-三甲基壳聚糖(PEG-g-TMC)，即使接枝率只有10%，聚合物在pH为1

4、14时都可溶于水，且与PEG的相对分子质量无关，最大溶解度能达到50g·L-1。而Jeong等4制备的不同接枝率的PEG-g-壳聚糖在水中的溶解度可达到300g·L-1以上。当前研究表明，PEG化壳聚糖在较宽pH值范围可溶于水，且能溶于部分有机溶剂中(如DMSO，二甲基酰胺等)，克服了壳聚糖在大分子药物如蛋白质、多肽药物和抗肿瘤药物传输系统的应用局限，同时对壳聚糖进行PEG化修饰还能降低其细胞毒性和溶血作用，从而增加其作为药物载体的生物相容性。然而，PEG能部分屏蔽壳聚糖链上的正电荷，虽然这有利于改善生物相容性，但会在一定程度上降低壳聚糖本身的生物黏附性和促吸收特性。因此，

5、如何通过PEG化程度、聚合物大小以及浓度等来优化处方，是促进蛋白质药物和基因药物体内作用的一个方向。另外，PEG化壳聚糖所制成的生物功能性材料因为PEG基团的加入，可以得到一些新的优良性能，促进了壳聚糖在生物组织工程中的应用。总之，随着研究的进一步深入，相信PEG化壳聚糖将会在生物医药领域发挥越来越大的作用。2文献综述壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，自1859年法国人Rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各

6、业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。针对患者，壳聚糖降血脂、降血糖的作用已有研究报告5。壳聚糖在特定的条件下，能发生水解、烷基化、酰基化、羧甲基化、磺化、硝化、卤化、氧化、还原、缩合和络合等化学反应，可生成各种具有不同性能的壳聚糖衍生物。上述反应在甲壳素和壳聚糖中引入了大的侧基，破坏了其结晶结构，因而其溶解性提高，从而扩大了壳聚糖的应用范围。 2.1接枝共聚接枝共聚是壳聚糖改性的重要方法之一，由于PEG易与壳聚糖发生交联，一般采用PEG单甲醚(mPEG)作为接枝单元，与壳聚糖或壳聚糖衍生物葡胺糖单元上的不同位置结

7、合，即可得到多种PEG化壳聚糖衍生物，如PEG-g-壳聚糖、PEG-g-壳聚糖季铵盐等。目前的接枝共聚衍生化反应主要在壳聚糖的2-N位置和6-C位置进行。N-PEG化壳聚糖合成方法主要有两步合成法和一步合成法。两步法6是常用的壳聚糖接枝方法，第一步先将mPEG活化，一般可通过二甲基亚砜(DMSO)、二重稳态自由基、醇氧化酶等氧化剂将MPEG氧化为聚乙二醇醛(mPEGA)，再在酸性水溶液条件下与壳聚糖上的伯氨基反应，即可得到-PEG化壳聚糖，其结构如图2-1。然而mPEGA的制备过程较复杂，活化程度低，且mPEGA易被氧化，反应中也难以避免醛醇缩合的发生。因此，Hu等改进了合成路线，先将mPEG

8、在三苯基亚磷酸盐的作用下与碘代甲烷反应得到碘化mPEG，再与6-三苯基甲基壳聚糖接枝，脱去三苯基甲基后便可得到N-PEG化壳聚糖。该路线不需使用催化剂，且简便易行。图2-1 PEG-g-壳聚糖的结构式一步反应法6是在甲酸溶液中，先将溶解的壳聚糖与mPEG混匀，再加入适量甲醛，壳聚糖上的氨基先与甲醛生成希夫碱中间体，再与mPEG上的羟基结合，即可得到PEG-g-壳聚糖。该方法制备简单，反应周期短，操作方便。Sugimoto7认为在对壳聚糖进行改性时，有必要保留其氨基糖结构单位和大部分氨基，因此对壳聚糖6位C上的改性就显得非常重要。Makugka等8先用邻苯二甲酸酐在干燥的二甲基酰胺中与壳聚糖反应

9、，使壳聚糖上的氨基得到保护，然后再通过取代反应即得到一系列6-mPEG衍生物，其结构如图2-2，所得到的壳聚糖衍生物均为浅木兰色粉末。图2-2 PEG-g-6-壳聚糖的结构式2.2交联改性交联改性是壳聚糖常用的改性方法，交联可以增强壳聚糖及其衍生物的力学强度和耐酸、耐有机溶剂性能。戊二醛是壳聚糖交联改性中最常用的交联剂，然而其细胞毒性和在肠道pH值下难以溶解的性质限制了它在药物传输系统中的应用。以PEG为交联剂得到的壳聚糖共聚物，不仅安全无毒，而且其溶胀性能明显提高。Kulkarni等9制备了PEG-壳聚糖交联聚合物，其结构如图2-3。发现在pH为7.4时，其泡胀率为130%250%，未交联的

10、壳聚糖在pH为7.4时泡胀率仅为100%。图2-3 PEG-壳聚糖交联共聚物的结构式在pH为1.1时，PEG-壳聚糖交联聚合物泡胀率为170%350%，壳聚糖则已经完全溶解。且当PEG的相对分子质量增加时，聚合物的泡胀率也随之增加。PEG-壳聚糖交联聚合物在不同pH值环境下均有良好的溶胀性，从而使其有潜力成为胃肠道缓释给药的载体。2.3嵌段共聚目前关于PEG-壳聚糖共聚物的研究较少，但其合成过程简单，可以克服PEG接枝壳聚糖共聚物的一些不足，不仅能改善其溶解性能，还赋予其一些新的功能。Ganji等10以KSO为自由基引发剂制备了PEG-壳聚糖聚合物，其结构如图2-4，作为新型的可注射的嵌段聚合

11、物，该聚合物展现出良好的温敏性，在低温时该聚合物为可注射的液体，而当温度达到体温时，便转化为不透明的凝胶，便于给药。图2-4 PEG-壳聚糖嵌段共聚物的结构式2.4 生物学特性将壳聚糖进行PEG化修饰后，既保留了壳聚糖及其衍生物本身的一些优良性质，如生物黏附性，促黏膜吸收等，还改善了壳聚糖的生物相容性，提高了壳聚糖作为药物载体的安全性。尽管壳聚糖一般被认为是安全、可生物降解且无毒的聚合物，但Schipper等11还是观察到某些壳聚糖的毒性。这是因为壳聚糖是一种阳离子聚合物，在体内易与红细胞的质膜相结合，并可能与带负电荷的细胞成分和蛋白结合，从而引起溶血、血栓形成及细胞破裂等安全性问题。而将壳聚

12、糖进行PEG化修饰后，由于PEG能在水中快速运动，并具有较大的立体排斥效应，可屏蔽掉一部分正电荷，从而降低了血小板和血浆蛋白的黏附作用和与细胞表面的接触，增加了聚合物的生物相容性。考察PEG化壳聚糖衍生物生物相容性的常用方法有溶血实验，细胞毒性实验和生物降解性研究。2.5 溶血性评价溶血实验主要考察阳离子聚合物与带负电荷的红细胞膜的相互作用。Zhu等12制备了PEG-g-壳聚糖季铵盐，并考察了不同浓度下壳聚糖季铵盐和PEG-g-壳聚糖季铵盐共聚物的溶血率。当共聚物浓度为2 mg·L-1时，壳聚糖季铵盐的溶血率为13.6%，而PEG-g-壳聚糖季铵盐的溶血率仅有7.1%，仅为壳聚糖季铵

13、盐溶血率的一半。这是由于PEG减少了共聚物与血浆蛋白和血小板的吸附，使溶血率下降。此外，实验还表明PEG的作用与其相对分子质量有关，具有较长分子链的PEG-5000与低相对分子质量的PEG相比，更能有效屏蔽共聚物的正电荷，提高材料在血液中的生物相容性。2.6 细胞毒性评价细胞毒性实验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境、检测材料接触机体组织后生物学反应的体外实验，Mao等13以L929小鼠成纤维细胞为模型测定了PEG-g-TMC对细胞代谢活性的影响，发现TMC具有一定的细胞毒性，且随着相对分子质量的增加而增强，TMC(400ku)的半数抑制浓度(IC)低至15 mg·L-1，而将其进

14、行PEG化修饰后，细胞毒性得到了显著性改善。当以相同相对分子质量(400ku)的壳聚糖季铵盐进行不同程度的PEG化修饰后，取代度增加与半抑制浓度增加呈线性关系，并且PEG-g-TMC与未修饰的TMC的细胞毒性有显著性差异。另外，100 ku和50 ku的TMC经PEG化修饰后，细胞毒性降为原有的1/10，孵育24h后，浓度为500 mg·L-1的两种聚合物溶液中仍有80%以上的细胞存活。此外，该组还以乳酸脱氧酶(LDH)实验测定了聚合物对细胞完整性的破坏程度。结果表明，PEG-g-TMC的LDH释放均低于6%，而未修饰的TMC的LDH释放率高达(50.5±3.1)%，是PE

15、G-g-TMC的8倍，这更证明了PEG修饰对壳聚糖衍生物细胞毒性的改善作用。2.7生物降解性研究壳聚糖衍生物与PEG均为可生物降解的高分子材料，而两者结合所得的共聚物也展现出良好的生物可降解性。Pozzo等14合成了PEG-壳聚糖交联共聚物，并以酶解法考察了产物的生物降解性。实验结果表明，聚合物对水解酶如木瓜蛋白酶和脂肪酶敏感，短时间内便有50%左右聚合物发生降解，而24 h后聚合物几乎全部降解。与此同时，聚合物并不会被溶解酵素、淀粉酶、胶原酶所降解。由此可以推测当该PEG化壳聚糖衍生物用于体内药物传输时，可被组织分布广泛的脂肪酶所逐渐降解，从而不会在体内蓄积。2.8 PEG化壳聚糖在生物医药

16、领域的应用PEG化壳聚糖具有卓越的生物黏附性以及促吸收特性，并且还是一种天然低毒的阳离子聚合物，易与带负电的多肽药物、基因、疫苗等相结合15，是生物医药领域极有应用价值的药物载体之一。3 技术路线3.1 壳聚糖的纯化称取50g壳聚糖，加入1mol·L-1NaOH溶液50mL，70搅拌条件下保温2 h，抽滤。滤饼用去离子水洗涤后于40下烘干。烘干后，溶于200 mL浓度为0.1 mol·L-1醋酸溶液中，过滤除去杂质，滤液用1mol·L-1NaOH溶液调节pH至8。用G4砂芯漏斗抽滤，去离子水反复冲洗至pH为中性，滤饼冷冻干燥。3.2 mPEG-g-CS的制备精密称

17、取100 mg纯化后的CS（分子量11万）溶解在4 ml 98%甲酸中，放置使其溶解完全。加入45mlDMSO稀释，室温磁力搅拌均匀。随后加入一定量mPEG，持续搅拌15 min，加入适量质量37%甲醛溶液，室温磁力搅拌1 h。将反应液移至透析袋（截留分子量8000-14000 Da）中，去离子水透析1天。将透析袋中的溶液转移至烧杯中，3 M NaOH调节pH值至13，布氏漏斗抽滤，再用无水乙醇洗涤滤饼。滤饼移入透析袋中，透析一天，除去里面混有的乙醇，冷冻干燥，得到产物。表3-1 制备不同取代度的聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖投料量mPEG（g）甲醛（l）理论取代度0.484615%1.009030

18、%3.3 mPEG-g-CS的凝胶色谱检测采用Agilent1100高效液相色谱系统检测mPEG-g-CS中残留的mPEG是否除尽。色谱条件：，TSKPWXLG4000凝胶色谱柱，流动相0.2 M CH3COOH，0.1 M CH3COONa，流速为0.6 ml/min，示差折光检测器，柱温30。标准品为不同分子量的葡聚糖：T-1(Mw=12,000)，T-2(Mw=50,000)，T-3(Mw=27,0000)，T-4(Mw=670,000)。将mPEG-g-CS溶解在超纯水中过夜，配制成浓度为2 mg/ml的溶液，过220 nm水系滤膜，进样检测。3.4 临界胶束浓度测定以嵌二萘为分子探针

19、，用荧光分光光度计测定不同取代度的mPEG-g-CS临界聚集浓度。精密称取3.0 mg嵌二萘，用50 ml甲醇溶解作为储备液。每次移取100 l储备液，于10 ml离心管中，自然挥干甲醇。分别将6 ml 1.0×10-54.0 mg/ml的12种不同浓度的样品加入到含上述离心管中，超声探头超声2 min（超1s，停1s），放置12 h后测定荧光光谱。自350nm到400nm进行荧光扫描，I3:波长385 nm，I1：波长373 nm。I1/ I3的强度比值对lg浓度作图计算CAC。（激发波长334nm）4 进度安排10月09日10月15日 查阅文献、仪器设备准备。10月16日11月1

20、2日 撰写开题报告、翻译文献。壳聚糖纯化，制备mPEG-g-CS， mPEG-g-CS的凝胶色谱检测和临界胶束浓度测定。11月13日11月18日 撰写论文。参考文献1Mouwa VK，Inamdar NChitosan-modifications and applications：opportunities galoreJReact FunctPolym，2008，68(6)：1013-10512 Harris JM，Struck EC，Case MG， a1Synthesis and characterization of poly(ethylene glyco1)derivativesJJ

21、 PolymSci：PolymChem Edi，1984，22(2)：341-3523孙毅毅，侯世祥，陈彤等壳聚糖-聚乙二醇接枝共聚物的合成与表征J四川大学学报(工程科学版)，2005，37(2)：76-794魏晓红，梁文权基因载体PEG化壳聚糖的制备及其表征J中国现代应用药学，2003，20(5)：383-3855 Mao SR，Shuai XT，Unger F，et a1Synthesis，characterization and cytotoxicity of poly(ethylene glyco1)-graft-trimethylehitosan block copolymersJB

22、iomaterials，2005，26(32)：6343-63566 Zhu SY，Qian F，Zhang Y,et a1Synthesis and characterization of PEG modified N-trimethylaminoethylmethacrylate chitosan nailopartielesJEurPolym J，2007，43(6)：2244-22537蒋新国生物药剂学与药物动力学M北京：高等教育出版社，20088谷福根，高永良，崔福德聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖自组装纳米球的制备J中国新药杂志，2005， 14(6)：686-6939 Kulkarni AR，YH，Liang HF，et a1A Novel