第五章 工程酶 固定化酶

1、第一节 概述第二节 固定化酶的制备第三节 固定化酶的性质工程酶whatwhenwhywhichhow1984年，英国剑桥大学学者Alan Fersht在其所著酶的结构和作用机制一书中，首次采用了工程酶engineering enzymes一词，来表达由基因工程技术制备的基因克隆酶和基因诱导酶凡是应用某种技术操作，对天然酶进行性能优化和其他人为研制的生物催化剂，都统称为工程酶酶对环境条件敏感，高温、过酸过碱易变性游离酶只能使用一次，不经济酶催化反应的产物与酶分离不便所催化的反应只有六类含量太少，产量不够，而且不具广谱性氧还酶转移酶水解酶裂合酶异构酶连接酶未发现天然存在的DNA酶单一的物理、化学方

2、法生物工程和化学工程相结合借助计算机优选数据，辅助设计如合成酶、印迹酶主要采用化学合成方法抗体酶、杂合酶、进化酶常采用蛋白质工程技术研制包括单元操作单元操作、化学反应工程化学反应工程、传传递过程递过程、化工热力学化工热力学、化工系统工化工系统工程程、过程动态学及控制过程动态学及控制等方面酶制剂催化反应后，和产物是混合在一起的，产物的纯度不高，并且酶制剂不能重复使用。如果将分离纯化后的酶固定到一定的载体上，使用时将被固定的酶投放到反应溶液中，催化反应结束后又能将被固定的酶回收那么这种固定化的酶就可以象一般化学反应的固体催化剂一样，既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并

3、且生产工艺可以连续化、自动化例如，将葡萄糖异构酶吸附到离子交换树脂上，或者包埋在明胶中，制成的固定化葡萄糖异构酶，不仅可以用于使葡萄糖转化成甜度更高的高果糖浆、而且可以在生产中反复使用。固定化酶的优缺点 多次使用 可以装柱连续反应优点： 纯化简单 更适合于多酶反应 应用范围广缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难 部分技术不够成熟不仅有实用价值，还有科研价值如固定化酶的研究有助于了解生物体中膜或凝胶类物质的微环境对酶功能的影响，利用固定化酶分离某些难于解离的寡聚体酶的亚基等等十二烷基硫酸钠SDS了解目标酶选择适当方法和操作评估固定化酶的实用价值活性中心活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性

4、中心的氨基酸基团：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害固有的高级结构不受到损害功能基团功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基等，当这些功：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合要避免用高温、强酸碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会要避免用高温、强酸碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。使酶变性失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。物理化学性质、结构等固定化酶的活力、固定化效率、酶活力回

5、收率、最适反应条件、使用稳定性什么原则 保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能起保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能起催化反应的特点催化反应的特点原则一 应该有利于生产自动化、连续化，有一定的机械强度，不应该有利于生产自动化、连续化，有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落能因机械搅拌而破碎或脱落原则二 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近接近原则三 酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用于反复使用原则四 固定化酶应能保持甚至超过

6、原有酶液的活性固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性原则五 应有最大的稳定性，在制备时，所选载体不与废物、产物应有最大的稳定性，在制备时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应或反应液发生化学反应原则六 固定化酶应易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就固定化酶应易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用可回收和重复使用原则七 固定化酶成本要低，应为廉价的、有利于推广的产品，以固定化酶成本要低，应为廉价的、有利于推广的产品，以便于工业使用便于工业使用原则八吸附法包埋法共价键结合法热处理法吸附法吸附法利用各种固体吸附剂将酶吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。利用各种固体吸附剂将

7、酶吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。一类是物理吸附。常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、一类是物理吸附。常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、硅胶、羟基磷灰石等。多孔陶瓷、硅胶、羟基磷灰石等。结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落另一类是离子交换剂吸附。以离子交换剂为载体，吸附带相反电荷另一类是离子交换剂吸附。以离子交换剂为载体，吸附带相反电荷的酶。常用离子交换剂有的酶。常用离子交换剂有DEAE-DEAE-纤维素，纤维素，DEAE-DEAE-葡聚糖等。葡聚糖等。吸附力更强，使用时要注意底物溶液的离子强度和吸附力更强，使用时要注意底

8、物溶液的离子强度和pHpH这些试剂也常用于色谱分离包埋法包埋法 将酶包埋在各种多孔载体中，将酶包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。使酶固定化的方法。 根据载体材料和方法的不同，可分为：根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶凝胶内部的内部的微孔中，制成一定形状的微孔中，制成一定形状的固定化酶。固定化酶。大多数为球状或大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰

9、胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。 微囊化包埋微囊化包埋法法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等 凝胶包埋法之凝胶包埋法之（1 1）琼脂凝胶包埋法）琼脂凝胶包埋法 将一定量的琼脂加入到一定体积的将一定量的琼脂加入到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至水中，加热使之溶解，然后冷却至48554855C C，加入一定量的酶液，迅速搅，加入一定量的酶液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯

10、或四拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶粒，分离后洗净备用。粒，分离后洗净备用。缺点：机械强度较差，底物、产物扩散缺点：机械强度较差，底物、产物扩散困难，故使用受限制困难，故使用受限制（2 2）海藻酸钙凝胶包埋法）海藻酸钙凝胶包埋法 称取一定量的海藻酸钠，溶于水，称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶液或细胞混菌冷却后，与一定体积的酶液或细胞混合均匀，然后用注射器或滴管将冷凝悬合均匀，然后用注射器或滴管将冷凝悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中。液滴到

11、一定浓度的氯化钙溶液中。优点：操作简便、条件温和，对细胞无优点：操作简便、条件温和，对细胞无毒害，通过改变海藻酸钠的浓度可以改毒害，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径。变凝胶的孔径。使用时注意控制培养基中磷酸盐的浓度，使用时注意控制培养基中磷酸盐的浓度，维持一定的钙离子浓度。维持一定的钙离子浓度。海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控（3 3）角叉菜胶包埋法）角叉菜胶包埋法角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属，自然分

12、布于角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属，自然分布于大西洋沿岸和我国东南沿海以及青岛、大连等海域，大西洋沿岸和我国东南沿海以及青岛、大连等海域，是中国的一种重要经济海藻。角叉菜不仅是卡拉胶生是中国的一种重要经济海藻。角叉菜不仅是卡拉胶生产的重要原藻，而且近年来越来越多地应用于医药领产的重要原藻，而且近年来越来越多地应用于医药领域，引起人们的广泛关注。域，引起人们的广泛关注。将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解。灭菌后冷却到解。灭菌后冷却到30-5030-50C C，与一定量的酶液等混合，与一定量的酶液等混合均匀后，趁热滴到预冷的氯化钾溶液

13、中，或者先滴到均匀后，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中的到球状冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中的到球状固定化颗粒。固定化颗粒。优点：通透性能好，对细胞无毒害。优点：通透性能好，对细胞无毒害。（4 4）明胶包埋法）明胶包埋法将一定量的明胶悬浮于一定体积的将一定量的明胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解。灭菌后冷却到水中，加热溶解。灭菌后冷却到3535C C以上，与一定量的酶液等混以上，与一定量的酶液等混合均匀后制成所需形状的胶粒。机合均匀后制成所需形状的胶粒。机械强度不够可用戊二醛等双功能试械强度不够可用戊二醛等双功能试剂交联。剂交联。分子结构中具有

14、两个或多个反应活泼基团的试剂功能基团相同则为同型试剂，不同则为杂型试剂（5 5）聚丙烯酰胺凝胶包埋法）聚丙烯酰胺凝胶包埋法先配置一定浓度的丙烯酰胺先配置一定浓度的丙烯酰胺arcarc和甲和甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺bisbis与一定量的酶液等与一定量的酶液等混合均匀后加入一定量的过硫酸钙混合均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，混合后让其静置和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合即可获得。聚合即可获得。优点：机械强度高，可调节凝胶孔径优点：机械强度高，可调节凝胶孔径缺点：丙烯酰胺单体有毒性缺点：丙烯酰胺单体有毒性arc的浓度arc和bis的比例（6 6）光交联树脂包埋法）光交联树脂包埋法例：相

15、对分子量为例：相对分子量为1000-30001000-3000的光交的光交联聚氨酯预聚物等，加入联聚氨酯预聚物等，加入1%1%左右的左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热光敏剂，加水配成一定浓度，加热至至5050，然后与一定浓度的细胞悬，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射层，用紫外照射3min3min，就可制得，就可制得凝胶包埋法总结凝胶凝胶包埋条件包埋条件 酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂聚

16、合反应聚合反应 部分失活部分失活 高高半透膜（微囊化）包埋法是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。半透膜的孔径只有几至几十，所以也称为微囊化法。 适用于底物和产物都是小分子物质的情况例如把红细胞置于含目的酶的高渗液中，使红细胞失水皱缩，漏出内容物而酶扩散进入，然后在等渗溶液中回复球状而成在酶的固定化过程中，酶与载体之间或酶与交联剂之间发生共价结合反应分为载体偶联法和交联法载体偶联固定化法概念：非水溶性载体与酶以共价键的形式结合可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键非水溶性载体保护酶的活性中心共价键结合法制备固

17、定化酶的“通式” 载体上引进活泼基团活化该活泼基团 此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键重氮法叠氮法烷基化反应法硅烷化法溴化氰法载体活化的方法交联法借助双功能试剂使酶分子之间或酶分子与惰性蛋白之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。交联法制备的固定化酶结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。 在酶液中加入适量双功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡酶直接交联法先将酶

18、吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶吸附交联法把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好交联包埋法热处理法热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制备得段时间，使酶固定在菌体内而制备得到的固定化菌体。到的固定化菌体。只适用于热稳定性较好的酶的固定化只适用于热稳定性较好的酶的固定化，要严格控制加热温度和时间。，要严格控制加热温度和时间。热处理法

19、也可以与交联法或其他固定热处理法也可以与交联法或其他固定化方法联合使用。化方法联合使用。各种固定化酶方法的优缺点比较各种固定化酶方法的优缺点比较 特性物理吸附法离子结合法包埋法共价结合法交联法制备易易易难易结合力中弱强强强酶活力高高高中中底物专一性无变化无变化无变化有变化有变化再生可能可能不可能不可能不可能固定化费用低低中中低1、包埋、共价结合、共价交联三种虽结合力强、但不能再生、回收；2、吸附法制备简单，成本低，能回收再生，但结合差，在受到离子强度、pH变化影响后，酶会从载体上游离下来。3、包埋法各方面较好，但不适于大分子底物和产物。 基本评估指标固定化酶的活力酶的固定化效率固定化酶的活力回

20、收率和相对活力固定化酶的半衰期酶在固定化前后的性质变化包括酶本身的 变化和载体或交联剂带来的影响核心问题就是酶固定化后的催化活性和稳定性的变化，以及最适反应条件的变化（一）固定化后酶活性变化（一）固定化后酶活性变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，专一性也可能发固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，专一性也可能发生变化。生变化。酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；中心的氨基酸；固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影

21、响到活性中心对底物的定位作用；响到活性中心对底物的定位作用；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能过膜与酶接包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能过膜与酶接近。近。1、热稳定性提高2、对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高3、固定化酶对不同pH稳定性提高4、抗蛋白酶的稳定性提高5、操作稳定性和贮藏稳定性提高（二）酶稳定性的变化（二）酶稳定性的变化固定化酶的热稳定性变化1. 固定化酶；2. 自然酶固定化后酶稳定性提高的原因，可能有以下几点：固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓慢

22、释放。抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。 （三）固定化酶的最适温（三）固定化酶的最适温度变化度变化 最适温度提高，以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度要比固定化前提高了30 。也有报道最适温度不变或下降的。载体带负电，载体带负电，pHpH向碱向碱性方向性方向移动载体移动载体带正带正电，电，pHpH向酸性方向移向酸性方向移动动载体催化反应的产物为酸催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最性时，固定化酶的最适适pHpH值比游离酶的值比游离酶的pHpH值高；反之则低值高；反之则低产物产物（四）固定化酶的最适pH变化 酶固定化后，对底物作用的最适pH和

23、活性-pH曲线常常发生偏移 影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质评价固定化酶的指标：评价固定化酶的指标：固定化酶的活力固定化酶的活力：每（克）干固定化酶所具有每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。的酶活力单位。 或：单位面积（或：单位面积（cmcm2 2）的酶活力单位表示（酶膜、）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。酶管、酶板）。 或：单位液体体积的酶活力单位表示（湿酶）或：单位液体体积的酶活力单位表示（湿酶）使反应速度达到某一稳定水平，与底物反应，间隔取样，终止反应并测定取样法固定化酶装入柱床，底物液流过柱床，收集流出液来测定连续法总蛋

24、白残留酶蛋白蛋白质含量不减，但部分会失活总酶活直接测定的固定化酶活力残留酶活残留在处理液和洗涤液中，并未与载体结合固定化酶的半衰期（固定化酶的半衰期（half-lifehalf-life）：衡量稳衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间活力下降为最初活力一半所需要的时间（t t1/21/2）半衰期半衰期t t1/21/2 = ln2/K = ln2/KD D = 0.693/K = 0.693/KD DK KD D称为衰减常数，称为衰减常数，K KD D=-2.303/t=-2.303/tlg lg（E/EE/E0 0）E/E

25、E/E0 0 为活力残留分数为活力残留分数将酶固定化制成固定化酶以后，由将酶固定化制成固定化酶以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化。能会有些变化。 构象效应屏蔽效应微扰效应分配效应扩散限制效应固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。固固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起。阻作用引起。作用于低分子底物的酶特异性没有明作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化显变化如氨基酰化酶

26、、葡萄糖氧化酶等如氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶等既可作用于低分子底物又可作用于高既可作用于低分子底物又可作用于高分子底物的酶特异性往往会变化。分子底物的酶特异性往往会变化。如胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白质，如胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白质，又可作用于低分子的二肽或多肽；固又可作用于低分子的二肽或多肽；固定在羧甲基纤维素上以后，对二肽或定在羧甲基纤维素上以后，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的作用仅为游离酶的3%3%左右。左右。紧邻固定化酶的狭小区域一 固定化酶载体的亲水疏水性、电荷性质等带来的影响二 酶颗粒表面的水化层与宏观体系之间的差异带

27、来的影响Nernst层分配效应和扩散限制载体的性质使底物和其他效应物在微环境和宏观体系之间不同性分配带来的影响当底物与载体带有相同电荷时，底物在酶的微环境中分配相对减少，相反则增大对于疏水性较强的载体，如果底物为极性物质，则在酶催化的微环境中分配相对减少，非极性则增大底物、产物和其他效应物在两种环境中的迁移速度差异称为扩散限制物质从宏观体系穿过几乎停滞的水化层时受到的限制作用称为外扩散限制。可以通过充分搅拌而减小物质穿过水化层后进一步向颗粒内部的酶分子所处的位点扩散时所受到的限制称为内扩散限制。取决于载体性质分配效应对固定化酶动力学性质的影响（4个方面）几乎没有影响不带电的情况很少发生1载体、

28、底物和其他效应物都不带电荷带同种电荷则相互排斥，底物不易进入载体，酶与底物接触几率减少带相反电荷则载体与底物相吸，酶与底物亲和力增强2载体、底物都带电载体带正电，固定化前后天冬酰胺酶活力的影响若载体带负电荷，则其表面吸附H+，所以外部溶液的H+浓度降低，即pH上升，酶活-pH曲线也会向碱性方向偏移，也就是最适pH发生碱移1 游离酶2 固定化酶疏水性载体能使作用于疏水性底物的固定化酶的米氏常数Km值变小，即酶与底物亲和力增强外扩散限制0.1，外扩散忽略不计。越大，外扩散影响越来越大50时，外扩散影响将超过同时存在的化学抑制剂的影响内扩散限制0.1，内扩散影响忽略不计，酶反应速度主要受化学抑制剂的

29、控制1时，酶反应同时受两者影响随着增大，化学抑制所占份额减小，但其浓度升高，反应速度仍会下降实践中如果反应速度因搅拌混合程度而改变，说明外扩散限制在起作用如果实效反应速度因酶颗粒大小而改变，则估计是内扩散限制的影响(1)(1)世界上第一种工业化生产的固定化酶世界上第一种工业化生产的固定化酶19691969年，日本田边制药公司将从米曲霉中年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-DEAE-葡葡聚糖凝胶为载体通过聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制离子键结合法制成固成固定化酶定化酶其催化反应的生产成本仅为用游离酶生产其催化反应的生产成本仅为用游离

30、酶生产成本的成本的6060左右左右固定化酶的应用（补充内容）（2）葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。（3 3）天冬氨酸酶）天冬氨酸酶 1973年日本用聚丙烯酰胺凝胶作为载体，将具有高活力天冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化酶，用于延胡索酸转化生产L-天冬氨酸。 也可以将天冬氨酸酶从大肠杆菌中提取出来，用离子键结合法制成固定化酶用于生产。NH3+（4 4）延胡索酸酶）延胡索酸酶19741974年，用年，用聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶，包埋，包埋的含有延胡索酸酶的的含有延胡索酸酶的产氨短杆菌产氨短杆菌菌菌体，制成固定化延胡索酸酶，生产体，制成固定化延胡索酸酶，生产L-

31、L-苹果酸。苹果酸。+H2OL L苹果酸是生物体可以利用的形式，它常苹果酸是生物体可以利用的形式，它常配以复合氨基酸注射液（手术后重要的营养配以复合氨基酸注射液（手术后重要的营养药品）中，以药品）中，以提高氨基酸的利用率提高氨基酸的利用率，这对手，这对手术后虚弱和肝功能障碍病人尤其重要。术后虚弱和肝功能障碍病人尤其重要。L L苹果酸钾是良好的苹果酸钾是良好的钾补充药钾补充药，它能保持人体，它能保持人体的水分平衡，治疗水肿、高血压和脂肪积聚的水分平衡，治疗水肿、高血压和脂肪积聚等症。等症。L L苹果酸是治疗肝病，尤其是肝功苹果酸是治疗肝病，尤其是肝功能障碍导致的高血氨症的良好药物。能障碍导致的高

32、血氨症的良好药物。L L苹苹果酸钠具有食盐的果酸钠具有食盐的1/31/3咸味，可作肾脏病人咸味，可作肾脏病人代食盐代食盐。 （5 5）脂肪酶）脂肪酶脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力的催化特点和催化活力。其中用于有机。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化酶的规模

33、化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。已经有学品和手性化合物有重要意义。已经有多种固定化脂肪酶多种固定化脂肪酶用于工业化生产用于工业化生产 2、固定化酶在医学上的应用作为治疗药物，溶液酶具有一些作为治疗药物，溶液酶具有一些“致命致命”弱点：弱点：酶酶作为异体物质，反复应用会作为异体物质，反复应用会导致免疫反应导致免疫反应 酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和除和被蛋白酶水解被蛋白酶水解破坏破坏 由于由于稀释效应稀释效应，药物酶无法集中于靶器官，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适组织以达到治疗所需的最适高浓度高浓度 溶液酶的这些

34、缺点，通过选择适宜的载体溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法将它们固定化以后就能逐一地加以与方法将它们固定化以后就能逐一地加以解决。解决。固定化酶由于其固定化酶由于其高稳定性，低免疫性高稳定性，低免疫性，使，使其在作为治疗药物时，较之溶液酶，表现其在作为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。出极大的优势。消血栓：消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，可在人体内引纤溶酶是异源蛋白质，可在人体内引起免疫反应，无法长期使用。起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。活。用包埋法制备的固定化酶可克服上述用包埋法制备的固定化酶可克服上述弊端，酶在囊中不

35、能漏出，小分子物弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。质能自由进出。人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附氨，再用活性炭吸附用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾将血液引出体外利用透析、过滤、吸附、将血液引出体外利用透析、过滤、吸附、膜分离等原理排除体内过剩的含氮化合物膜分离等原理排除体内过剩的含氮化合物，新陈代谢产物或逾量药物等，调节电解，新陈代谢产物或逾量药物等，调节电解质平衡，然后再将净化的血液引回体内。质平衡，然后再将净化的血液引回体内。利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成利用固定化脲

36、酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，能大大提高了疗效的体外循环装置，能大大提高了疗效酶传感器是由固定化酶与能量转换器两部分组酶传感器是由固定化酶与能量转换器两部分组成的传感装置，其中酶是与适当的载体结合形成的传感装置，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。成的不溶于水的固定化酶膜。最常用的酶传感器是最常用的酶传感器是酶电极酶电极，即将固定化酶膜，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。物质并将其转换为电信号输出。固定

37、化酶和电化学传感器结合的优点既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。 酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。的传感装置。19621962年年ClarkClark和和LyonsLyons提出模提出模型，型，19671967年年UpdikeUpdike和和HicksHicks首先制造出酶电首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析极并把它用于葡萄糖的定量分析酶电极一般可根据电极检测物理量的不同酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、分为电流

38、型和电压型，前者一般有氧电极、H H2 2O O2 2电极等，后者有电极等，后者有NHNH3 3、COCO2 2、H H2 2电极等。电极等。较典型的一种酶电极为较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极葡萄糖酶电极。例：用聚丙烯酰胺凝胶包埋法将葡例：用聚丙烯酰胺凝胶包埋法将葡萄糖氧化酶固定化，制成厚度为萄糖氧化酶固定化，制成厚度为202050m50m的酶膜，再与氧电极和的酶膜，再与氧电极和使氧容易通过的聚四氟乙烯等高分使氧容易通过的聚四氟乙烯等高分子薄膜密切结合，组成葡萄糖氧化子薄膜密切结合，组成葡萄糖氧化酶电极。酶电极。使用时，把酶电极浸入样品溶液中，使用时，把酶电极浸入样品溶液中，样品液中的葡萄糖

39、扩散到酶膜中，样品液中的葡萄糖扩散到酶膜中，酶催化葡萄糖与氧反应，生成葡萄酶催化葡萄糖与氧反应，生成葡萄糖酸，使氧被消耗，再由氧电极测糖酸，使氧被消耗，再由氧电极测定氧浓度的变化，即可知道样品中定氧浓度的变化，即可知道样品中葡萄糖的浓度。葡萄糖的浓度。酶电极酶电极特点：快速、方便、灵敏、特点：快速、方便、灵敏、精确精确固定化方法一般采用固定化方法一般采用凝胶包凝胶包埋法，制成酶膜埋法，制成酶膜。一些常见的酶电极底底 物物酶酶电电 极极55腺苷酸腺苷酸55腺苷酸脱氨酶腺苷酸脱氨酶NHNH4 4+ +乙醇，醇乙醇，醇乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶PtPt过氧化物过氧化物过氧化氢酶过氧化氢酶Pt (OPt (

40、O2 2) )磷酸葡萄磷酸葡萄硫酸酯酶硫酸酯酶+ +葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶Pt (OPt (O2 2) )D-D-氨基酸氨基酸D D氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶NHNH4 4+ +L-L-氨基酸氨基酸L L氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶NHNH3 3蔗糖蔗糖蔗糖酶蔗糖酶+ +葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶Pt (HPt (H2 2O O2 2) )琥珀酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶Pt (OPt (O2 2) )硫酸酯硫酸酯芳基硫酸酯酶芳基硫酸酯酶PtPt硫氰酸硫氰酸硫氰酸酶硫氰酸酶CNCN硝酸盐硝酸盐硝酸盐还原酶硝酸盐还原酶/ / 亚硝酸盐还原酶亚硝酸盐还原酶NHNH4 4+ +亚硝酸盐亚硝酸盐亚硝酸盐

41、还原酶亚硝酸盐还原酶NHNH3 3（气体）（气体）草酸草酸草酸脱羧酶草酸脱羧酶COCO2 2（气体）（气体）青霉素青霉素青霉素酶青霉素酶pHpH乳酸乳酸乳酸脱氢酶；细胞色素乳酸脱氢酶；细胞色素b bPtPt，FeFe（CNCN）-4-4L L氨基酸氨基酸脱羧酶脱羧酶COCO2 2L L精氨酸精氨酸精氨酸酶精氨酸酶NHNH4 4+ +L L天冬酰胺天冬酰胺天冬酰胺酶天冬酰胺酶NHNH4 4+ +（2 2）水质监测）水质监测用化学法测定酚时，硫化物、油用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。类等可干扰其测定。从马铃薯中提纯、经吸附交联得从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的到的固定化多酚氧化酶固定

42、化多酚氧化酶与氧电极与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物类化合物。德国研发的环境废水BOD分析仪（3）食品鲜度鱼鲜度传感器在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K值表示大多数鱼死后大多数鱼死后5 520h20h，ATPATP，ADPADP和和AMPAMP已分已分解尽，超过解尽，超过24h24h，鲜度主要取决于，鲜度主要取决于IMP-IMP-肌肌苷苷-次黄嘌呤次黄嘌呤-尿酸。尿酸。将这三个步骤的三种酶（将这三个步骤的三种酶（5 5 核苷酸酶、核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧

43、化酶）固定在氧核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。电极上，制成鱼鲜度测定仪。 当当K K2020时，鱼极新鲜，可供生食。时，鱼极新鲜，可供生食。 K K在在20204040之间为新鲜，必须熟食。之间为新鲜，必须熟食。 K K大于大于4040，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。检验结果相一致。肉鲜度传感器肉鲜度传感器肉类在腐败过程中会产生各种胺肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。鲜程度。用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，或用单胺氧成多胺生物

44、传感器，或用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。测定肉在贮藏过程中的鲜度。固定化酶的缺点成本较高无法利用辅酶因子只能单一酶反应细胞的固定化细胞的固定化固定化细胞固定化细胞就是就是被限制自由移动的细胞被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。能被反复或连续使用的活力。 1、固定化细胞与固定化酶比较，其优越性在于1 1、固定化细胞保持了胞内酶系的原始、固定化细胞保持了胞内酶系的原始状

45、态与天然环境，因而更稳定状态与天然环境，因而更稳定2 2、固定化细胞保持了胞内原有的多酶、固定化细胞保持了胞内原有的多酶系统，这对于多步催化转换，如合成系统，这对于多步催化转换，如合成干扰素等，其优势更加明显干扰素等，其优势更加明显3 3、无需辅酶再生。尤其是固定化增殖、无需辅酶再生。尤其是固定化增殖细胞发酵更具有显著优越性细胞发酵更具有显著优越性按细胞类型按生理状态微生物植 物动 物死细胞：完整细胞，细胞碎片，细胞器活细胞：增殖细胞，静止细胞，饥饿细胞固定化细胞分类、形态特征和生理状态固定化细胞分类、形态特征和生理状态 （1 1）固定化细胞由于其用途和制备方法的不）固定化细胞由于其用途和制备

46、方法的不同，可以是同，可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状或颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则状不规则状等，目前大多数制备成颗粒状珠体等，目前大多数制备成颗粒状珠体 （2 2）细胞被固定在载体内在形态学上一般）细胞被固定在载体内在形态学上一般没有明显的变化。没有明显的变化。通过光学显微镜、电子通过光学显微镜、电子显微镜观测表明细胞的形态与自然细胞没显微镜观测表明细胞的形态与自然细胞没有明显差别。但是，扫描电镜观察到固定有明显差别。但是，扫描电镜观察到固定化酵母细胞膜有化酵母细胞膜有内陷内陷现象。现象。 2、固定化细、固定化细胞形态特征胞形态特征固定化死细胞固定化死细胞一般在固定化之前或之后细胞经过

47、一般在固定化之前或之后细胞经过物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、物理或化学方法的处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加细冷冻、酸及表面活性剂等处理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单酶胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单酶催化的反应。催化的反应。 固定化静止细胞和饥饿细胞固定化静止细胞和饥饿细胞在固定化之后细胞是在固定化之后细胞是活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长活的，但是由于采用了控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。繁殖，而是处于休眠状态或饥饿状态。固定化生长细胞固定化生长细胞又称固定化增殖细胞，是将活细

48、又称固定化增殖细胞，是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。 3、固定化细胞生理状态、固定化细胞生理状态固定化固定化增殖增殖细胞细胞与固定化酶和固定化死细胞与固定化酶和固定化死细胞比较，比较，1、细胞能够不断繁殖、更新，反应所需的、细胞能够不断繁殖、更新，反应所需的酶也就可以不断更新，而且酶也就可以不断更新，而且反应酶处于天然反应酶处于天然的环境的环境中，更加稳定，因此，固定化增殖细中，更加稳定，因此，固定化增殖细胞更适宜于连续使用。胞更适宜于连续使用。2、从理论上讲，只

49、要载体不解体，不污染，、从理论上讲，只要载体不解体，不污染，就可以长期使用。就可以长期使用。3、固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部、固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部酶活性，因此，更适合于进行酶活性，因此，更适合于进行多酶顺序连续多酶顺序连续反应反应固定化细胞的制备固定化细胞的制备 1 1、化学法涉及酶或细胞的化学修饰。由、化学法涉及酶或细胞的化学修饰。由于所用化学药品的毒性，这类方法可引起于所用化学药品的毒性，这类方法可引起细胞破坏细胞破坏。2 2、吸附螯合法制备固定化细胞条件温和、吸附螯合法制备固定化细胞条件温和、方法简便，但载体和细胞间、方法简便，但载体和细胞间吸附力弱吸附力弱，操作时细

50、胞易从载体脱落，特别是底物分操作时细胞易从载体脱落，特别是底物分子量高，介质的离子强度和子量高，介质的离子强度和pHpH变化情况下变化情况下更是如此，所以操作稳定性差，但优点是更是如此，所以操作稳定性差，但优点是可再生可再生。3 3、包埋法从理论上来说细胞和载体、包埋法从理论上来说细胞和载体间没有束缚，固定化后应保持高活力，间没有束缚，固定化后应保持高活力，然而实际上限制酶活力的因素较多，然而实际上限制酶活力的因素较多，而且这类方法而且这类方法只适于小分子底物只适于小分子底物。要。要固定活细胞、增殖细胞显然包埋法占固定活细胞、增殖细胞显然包埋法占优势，尤其采用卡拉胶、海藻酸钙等优势，尤其采用卡

51、拉胶、海藻酸钙等材料更好。材料更好。4 4、交联法没有良好机械强度，所以、交联法没有良好机械强度，所以不适于实际应用。但可得到高细胞浓不适于实际应用。但可得到高细胞浓度，大多数情况度，大多数情况难于再生难于再生。辅酶固定化的原因：辅酶在使用过程中要流失，并且不能自行再生辅酶价格昂贵工业上应用全酶的关键是辅酶的保留和再生作为酶的辅因子的有机分子，本身无催化作用，但一般在酶促反应中有传递电子、原子或某些功能基团(如参与氧化还原或运载酰基的基团)的作用，与酶较为松散地结合，对于特定酶的活性发挥是必要的辅酶的固定化辅酶的固定化1、应选择合适的载体。目前使用的、应选择合适的载体。目前使用的载体主要有载体

52、主要有琼脂糖琼脂糖，此外还有纤维，此外还有纤维素、玻璃珠及合成高分子载体等素、玻璃珠及合成高分子载体等2、间隔臂（手臂）的选择也非常重、间隔臂（手臂）的选择也非常重要。一般辅基分子和载体之间需要要。一般辅基分子和载体之间需要0.51.0 nm长的手臂长的手臂将辅酶和酶固定在同一个载体上，可将辅酶和酶固定在同一个载体上，可得到一种不需外加辅酶而活性持久的得到一种不需外加辅酶而活性持久的固定化酶。固定化酶。图2-7辅酶和酶固定化的反应系统A：辅酶与酶共固定在载体上；B：通过间隔臂将辅因子直接固定在酶分子上 1、概述（1）基本概念：将微生物细胞和植物细胞去细胞壁后，可得原生质体（动物细胞可视为原生质体），将此原生质体用多孔凝胶包埋，即为固定化原生质体。（2）固定化