AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程

1、文件名称AB7500荧光定量PCR仪使用、维护、校准标准操作规程颁发部门制订人：复核人：批准人：质保部制订日期：复核日期：批准日期：执行日期版本1.0编RSOP04006制作份数份发送部门修订记录修订人修订原因修订内容版本修订日期1 .目的：确保荧光定量PCR仪能够正确和正常的使用，保证扩增及结果分析的标准化、规范化。2 .范围：适用于AB7500荧光定量PCR仪的使用及维护。3 .定义：无4 .职责：荧光定量PCR仪使用人员负责本规程的实施。质保部对本规定的有效执行承担监督检查责任。5 .内容：5.1 室内温度控制在 1530 C,相对湿度 4575%。5.2 仪器操作5.2.1 依次打开电

2、脑显示器和电脑主机的电源开关，进入 Windows界面。5.2.2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热 10分钟。5.2.3 点击7500 Software v2.3 图标，打开软件。5.2.4 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测的 8联PCR反应管或者96孔PCR反应 板放入检测孔位，记下放置位置。检测 8联PCR反应管用*反应孔模块，检测 96孔PCR反应 板用*反应孔模块。(检测8联PCR反应管需放入盖紧管盖的空8联PCR反应管配平，检测 96孔PCR反应板无需配平)5.2.5 再次按压托盘使其滑入仪器。5.2.6 新建扩增参数模板：例如新建一个UG-63-62的模板，

3、扩增参数是 95° , 10' (95° , 10； 63°,45") X5 cycles ; (95°, 10" 62°, 35") >40 cycles ,在 62°时收集荧光信号 (HEX、FAM 信号)，20反应体系。5.2.6.1 在 Setup-Plate Setup-Define Targets and Samples 中，将 Target Name 下的 Targetl 改成 FAM ; 点击Add New Target ,将新增的 Target1改成HEX ,点击 Repo

4、rtee下拉菜单，选择 VIC。5.2.6.2 在 Setup-Run Method-Graphical View 中的 Reaction Volume Per Well后面输入 20 （20 口反应体系）。选中第一个 Holding Stage，点击 Delete Selected 删除；在 Cycling Stage 中的 Number of Cycles后输入5 ,在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度63度，输入时间45秒， 将63度下面收集荧光图标点掉；点击 Add Stage 下拉菜单选择 Cycling ,在Cycling Stage 中 的Number of Cy

5、cles 后输入40 ,在Step1中输入时间10秒，在Step2中输入温度 62度，输 入时间35秒，在62度下面点击图标收集荧光。5.2.6.3 点击 Save 下拉菜 单下的 Save As Tamplate ,文件 名输入 UG-63-62 ,保存在默认 ab7500-config-tamplates文件夹内，关闭设置界面。5.2.7 已有扩增参数模板：在软件 Home界面中点击 Template ,选择需要的模板，点击打开。例如： UG-63-62 ,其扩增参数就是 95°, 10' （95°, 10" 63°, 45）X5 cycle

6、s ; （95°, 10" 62°, 35"） >40 cycles ,在 62°时收集荧光信号（HEX、FAM 信号），Reaction Volume Per Well :201（201反应体系）。5.2.8 在 Setup-Plate Setup-Assign Targets and Samples 中选择 8 联管摆放的位置，全部勾选 Sample 1 ; UGT1A1*6 勾选 HEX, UGT1A1*28 勾选 FAM。5.2.9 在Run-Amplification Plot中点击 START RUN ,命名为20140101

7、-1 （当日日期+当日上机次数， 例:2014年1月1日第1次上机编号为20140101-1 ），保存在默认文件夹中，开始运行。5.2.10 结果分析5.2.10.1 PCR反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析。5.2.10.2 也可根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以（用户可根据实际，f#况自行调整，Start值可以在 315、End值可设在 520）, Threshold 值（Rn ）推荐设定为 500015000，点 击Analyze进行分析，然后到 Plate窗口下记录每个反应的Ct值。5.2.11 实验结束后取出反应管（切勿打开管盖），顺序关闭AB750

8、0软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。5.3 仪器维护5.3.1 每周维护5.3.1.1 检查计算机磁盘空间。如需要，将实验文件归档或备份。?至少每周检查一次计算机磁盘空间。?如果硬盘的可用空间不足其总容量的20% ,应将较陈旧的数据传输到备份存储设备上保存。5.3.1.2 关闭控制7500 Instrument的计算机，30秒后再次开启计算机。5.3.1.3 用无绒布块（不脱毛）蘸取75%酒精清洁7500 Instrument的表面。（注：切勿使用有机溶剂清洁 7500 Instrument 。）5.3.1.4 使用75%酒精浸泡反应管托架（晾干后放回仪器内）。5.3.2 每月维护5.3.2.

9、1 执行背景校准。（可执行一次背景校准以检查是否存在污染物）5.3.2.2 运行磁盘清理和磁盘碎片整理。?至少每月一次。?当Windows ?操作系统显示消息提示执行碎片整理时。?切勿同时运行磁盘管理实用工具和7500 Real-Time PCR Software 。5.3.3 每半年（6个月）维护5.3.3.1 检查灯具状态。在 7500 Software 中，选择 Instrument fLamp Status/Replacement以确定卤素灯的状态。显示 Lamp Status/Replacement对话框：? Condition -表示以下其中一种状况：- Good -灯具工作良好，

10、不需要更换。单击Close。- Failed -必须更换灯具。单击 Close ,然后按照5.3.4.3步骤更换卤素灯。- Change Soon-灯具使用超过 2000小时；生产商建议将其更换。单击Close ,然后决定是否更换灯具。如果决定更换，请按照5.3.4.3步骤更换卤素灯。? Usage （Hours）-灯具已照明的总小时数。? Lamp Current -灯具的输出电流，以安培为单位 （A）。低电流意味着灯具可能将要失效。? Date Last Replaced -上次更换灯具的日期。Lamp Status J ReplacementXCurent Lamp StatusCond

11、itl or:GoodUsage (Hours):0Lamp Current:UnknownDate Last Replaced: 10/01J2007Replace Lam|)You mustresetthe lamp timer前即 repiacins ffie lamp.| 皿臼2NOTE: The lamp timer can only be resertwhenttie instrument is idle Close在执行一次运行之前或期间,7500 Software可能显示以下警告:消息描述Warning - Cannot detect sufficientcurrent fro

12、m在运行开始时，灯具电流彳氐于可接受水平。在lamp. Either lamp is notinstalled properly or按攵5.3.4.3步骤更换卤素灯具之前，无法继needs to bereplaced.续该运行。Warning - Cannot detect sufficientcurrent from7500 Software停止了该次运行，因为在运行lamp. Either lamp is notinstalled properly or中灯具电流下降到可接受水平之下。在按照needs to bereplaced.5.3.4.3步骤更换卤素灯具之前，无法继续该运行。在消息

13、框中单击 OK,检查仪器日志，然后更换灯具。Warning - The lamp usage hasexceeded 2000在运行开始时，灯具使用时间超过2000小时。hr. We recommendreplacing the lamp soon to单击Cancel Run ,然后更换灯具，或者单击ensure optimal assay performance.Continue Run。重新运行 ROI、背景、光学和染料校准。5.3.3.2 执行目标区（ROI）校正。5.3.3.3 执行背景校准。5.3.3.4 执行光学校准。5.3.3.5 执行染料校准。5.3.3.6 执行RNase

14、P仪器验证试验。5.3.4 其它维护任务（需要时执行）5.3.4.1 样本块污染清除。执行以下程序，去除 7500 Instrument样本块的荧光污染。荧光污染是导致背景运行失败的常见原因，在此情况下，一个或多个反应孔会持续表现出异常的高信号。注意！切勿移去设备上的盖板。7500 Instrument中没有用户可安全维修的组件。如果怀疑存在问题，请联系生产商服务代表。全程戴上一次性无粉手套操作。找到样本块中受污染的反应孔（参阅5.4.2.13“如何确定污染”）。从7500 Real-Time PCR Instrument中取出反应板和托盘支架。a.按压托盘门，将其打开。b.取出反应板和托盘支

15、架。c.关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。手动降低样本块:a.在 7500 Software 中，选择 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。b.在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 选项卡中,单击 Start Manual Calibration 。c .在 ROI Inspector 对话框中，单击 Move Block。d.当 ROI Inspector 对话框显示"Block Down ”时，单击 Done。关闭7500 Real-Time PCR Instrument ,然后拔

16、下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。打开 7500 Real-Time PCR Instrument的检查门。a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。b.打开仪器前门。抬起门栓，然后将受热的护盖门推到仪器的背面。使用少量的双蒸水，清洁样本块中被污染的反应孔:a.用移液管吸取少量双蒸水并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的双蒸水数次，以冲洗反应孔。c.将用过的双蒸水水吸入废液瓶中。d.使用棉花拭子，擦试每个被污染的反应孔的内壁。e.使用无绒布料，吸出残余的双蒸水。打开 7500 Real-Time PCR Instrument 的检查门。7500 Real-

17、Time PCR Instrument将受热的护盖门拉到仪器的正面。抬起门栓，然后将受热的护盖门紧固到交叉杆。插上电源插头并开启7500 Instrument 。?通过执行背景校准运行确认已消除污染（参阅 5.4.2“背景校准”）。?如果污染仍然存在，重复步骤至，然后使用95%乙醇溶液清洁样本块中受污染的反应孔:a.用移液管吸取少量 95%乙醇溶液并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。c.将用过的乙醇溶液吸入废液瓶中。重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用双蒸水冲洗反应孔。?重复步骤至？，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。?如果

18、污染仍然存在，重复步骤至，然后使用10%漂白剂溶液清洁样本块中受污染的反应 孔：a.用移液管吸取少量10%漂白剂溶液并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。c.将用过的漂白剂溶液吸入废液瓶中。重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用去离子水冲洗反应孔。?重复步骤至？，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。如果仍有污染，请与生 产商技术支持联系。?确保受热盖门完全关闭并上闩。如果没有，则7500 Software显示错误消息。5.3.4.2 移动PCR仪。（更换或移动光学器件的任何部件后，必须执行ROI校准、背景校准、光学校准、染料校准以

19、及RNase P仪器验证。）5.3.4.3 更换卤素灯。全程戴上一次性无粉手套操作。关闭7500 Instrument ,然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却 15分钟。a.注意！灼热。7500 Instrument和灯具灼热！灯具在使用中会变得非常灼热。在处理灯具之前，应允许灯具冷却 15分钟，并戴上无粉防护手套。b.重要！为避免灼伤及缩短新灯具的使用寿命，处理灯具时请戴上一次性无粉手套。c.注意！ 7500 Instrument 按设计仅可使用 12V、75W 的卤素灯。打开7500 Instrument的检查门。a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。b.打开仪器前门

20、。从仪器中取出灯具：a.向下滑动灯具释放杆。b.用手紧紧地抓住卤素灯并向上提，使灯具从安装槽口中脱出。ab查看灯具并确定有无故障迹象（有故障的灯具内壁上通常有碳黑层）。将新灯具安装至仪器上:关闭仪器前门。a.向上滑动灯具释放杆。b.用手紧紧地握住灯具，将灯具放入带槽口的安装座内，然后小心地向下滑动灯具，使其到打开 ROI Inspector 对话框:在 ROI Inspector 对话框中，选择 Lamp Control fIdle。?当仪器运行时，通过检查门上的缝隙观察，确保灯具发光，然后单击Done。应看到灯光插上电源插头并开启7500 Instrument 。a.在 7500 Softw

21、are中, 选择 Instrument f Instrument Maintenance Managerb.在 Instrument Maintenance Manager的 ROI 选项卡中，单击 Start Manual Calibration 。?如果灯具发光，在 7500 Software 中选择 Instrument Lamp Status/Replacement ,单击Reset Lamp Timer ,然后单击OK。如果灯具不发光，则替换的卤素灯可能有缺陷。重新更换 灯具。如果再次更换灯具后仍不发光，检查仪器的保险丝是否存在故障（参阅第71页）。?更换灯具后，按顺序执行以下校准。

22、请参阅：? 5.4.1目标区（ROI）校准? 5.4.2背景校准? 5.4.3光学校准? 5.4.4染料校准? 5.4.5验证仪器性能5.3.4.4 更换 7500 Instrument 保险丝。保险丝损坏时，更换 7500 Real-Time PCR Instrument保险丝。（注意！为在长时间内防止火灾，更换保险丝时请使用类型和额定值与仪器原始保险丝相同的经认可的保险丝。）全程戴上一次性无粉手套操作。关闭仪器电源，并拔下电源插头。使用平口螺丝刀从仪器上旋松并卸下保险丝座。使用12.5A、250V、5X 20mm保险丝更换损坏的保险丝。注：电压和电流额定值见保险丝座。插上电源插头，然后开启

23、仪器。如果仪器接通了电源，说明保险丝已安装成功。注：保险丝损坏可能是由仪器供电电源波动导致。为了防止继续出现故障，可以考虑安装电气保护设备，例如 UPS或其他电涌保护器。5.3.4.5 更新 Windows ?操作系统。5.3.4.6 更新 7500 Software 。5.3.4.7 监控仪器状态（使用 Function Test对话框又主要 7500 Instrument组件执行高级诊断。一般情况下不需要执行功能测试，除非怀疑有硬件故障，或者 Life Technologies代表指示这样做。）在 7500 Software 中，选择 Instrument fFunction-Test 。

24、根据需要执行功能测试。要测试：所有组件-单击 All Tests ,然后等候软件执行所有功能测试。一个或多个特定组件-单击以下其中一项或多项。? USB -测试 7500 Real-Time PCR Instrument和计算机之间的通用串行总线（USB）连接。如果7500 Software 能够和7500 Real-Time PCR Instrument建立通信，则表示测试通过。? CCD -测试7500 Real-Time PCR Instrument 内的CCD摄像机。如果摄像机能够拍摄 图像，则表示测试通过。? Filter Wheel -测试7500 Real-Time PCR In

25、strument内的过滤轮。如果过滤轮控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。? Shutter -测试7500 Real-Time PCR Instrument的光学快门。如果快门控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。? Lamp -测试7500 Real-Time PCR Instrument的卤素灯。如果灯具控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。? Thermal Cycler -测试7500 Real-Time PCR Instrument内的热循环仪样本块。如果热循环仪的控制器运行正确版本的固件，则表示测试通过。当7500 Software完成一项测试时，软件报告该测试的通

26、过/失败状态，并提供结果描述。Function TestTestPass/FaiiDescriptionUSB _-1Pass|USB check passed.CCDPass|CCD check passedFiler VWioolPass|Filter Wheel check passelShutterPass|Sh utter clie;k passed.LaiTipPass|Lamp check passed.Thermo Cycler禺:PassPassThermo CyclercheckpassedClose结束测试时，单击 Close。5.4 仪器校准5.4.1 目标区（ROI）

27、校准5.4.1.1 全程戴上一次性无粉手套操作。5.4.1.2 从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。5.4.1.3 让ROI校准反应板温度上升至室内温度（约需 5分钟）。在立即运行反应板之前，不要从包装袋 内取出ROI校准反应板。反应孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间曝光可降低染料在反应 板中的荧光。5.4.1.4 从包装袋中取出 ROI校准反应板。将光学薄膜留在反应板上。不要丢弃存放ROI校准反应板的包装袋。若贮存于原始包袋中，反应板最多可重复使用三次。5.4.1.5 振荡ROI校准反应板5秒钟。5.4.1.6 用板式离心机将反应板离心2分钟。ROI校准反应板必须充分混合

28、并离心。5.4.1.7 确认ROI校准反应板每个反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更高的转速及更 长的时间离心反应板。5.4.1.8 按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐。（装入标准反应板，使 A12凹口位置位于托盘的右上角。）5.4.1.9 以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。5.4.1.10 执行自动 ROI校准在 7500 Software 中，选择 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 的

29、ROI 选项卡中，单击 Start Calibration 。按照向导的指示，完成校准。ROI Calibration 对话框显示三个选项卡：? Setup -显示ROI校准设置说明。单击 Next提示可以打开 Run选项卡。? Run -单击START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击 Next提示可以打开Analysis 选项卡。? Analysis -指明校准状态（Passed/Failed ）。如果校准失败，请参阅 5.4.1.13 "排除ROI校准故障”。5.4.1.11 执行手动ROI校准在 7500 Software 中，选择 Instrument fInst

30、rument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 的 ROI 选项卡中，单击 Start Manual Calibration 。在ROI Inspector对话框中（如图 1）:a.在 Exposure Time 字段中，输入 2048。b.选才i Filter A （滤光器1）。图1单击Snapshot ,生成一张 ROI图像。确定ROI图像是否可接受（下图所示为未饱和以及过饱和的图像）。可接受图像中的反应孔：?在不过饱和的前提下，必须尽可能明亮。（生成ROI校准时，如果反应孔过饱和，则显示一条警告。）?可以含有但不是

31、必须含有红色像素（表示饱和）。未饱和正常饱和过度饱和如果ROI图像可接受，转至步骤。如果 ROI图像过饱和，将 Exposure Time降低一半,然后单击Snapshot 。重复执行，直至获得可接受的ROI图像。如果无法获得可接受的图像，请参阅5.4.1.13 "排除ROI校准故障”。单击Generate Calibration 。 7500 Software 采集一张截图，然后显示一个消息框或ROI图像:执行:如果软件显示:7500 V2.0Olmaqe exposure 过 too low for valid calibratior, possible tad始交(1) Low

32、 exposure(2) Missing calibration plate(3) Lamp isar burned out(4) 5hutter ts closedThe caiibMtion process will not continue with the ourrentPlease increas* the esposure time and try dgain.ROI图像非常模糊或者无法成功校准。可接受的校准图像注：在所有反应孔周围出现绿色圆圈，表示反应孔成功校准。a.单击OK。b. 将 Exposure Time 降彳氐半（参阅5.4.1.11步骤a）。c.重复步骤和。请参阅5.

33、4.1.13 "排除ROI校准故障”。验证以下各项:?Wells Found 值为 96。" iXibjir neii? F uFile-.百 A成功校准- Wells Found 必须为96。注：绿色圆圈表示反应孔位置的目标区已足够亮。？在ROI图像上每个反应孔区的周围显示绿色圆圈。单击 Save Calibration 。Exposure Time 重置为软件保存滤光器 1新产生的ROI校准。在ROI Inspector的Filter Masks Loaded 区域，"OK" 出现在滤光器1旁边。对其余滤光器重复步骤至，对每个滤光器执行校准之前，将2

34、048。当所有滤光器的Filter Masks Loaded 都显示 OK时，ROI校准完成。工用吐lit I IT£115| IsMSCoflNl人1* 广513亡;血中UfnRr®，0#京 LoaoBdA OKI OKFmI IntemiM ISWdH Qrd 学E> OsLOK当所有滤光器的Filter Masks Loaded都是OK时，校准完成。点击Done。5.4.1.12 拆卸反应板（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100。Co若刚使用过仪器,在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。）取出校准反应板：a.按压托盘门，将其打开。b.取出校准反应

35、板。c.按压托盘门，将其关闭。将校准反应板放入其包装套中。如果要执行背景和光学校准：a.在接下来的8小时，将ROI校准反应板置于室温下。光学校准使用ROI校准反应板。b.第二天将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。c.重要！不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在打开其包装后最多可重复使用反应板 3次。d.重要！执行ROI校准后，也必须执行背景校准、光学校准、染料校准以及仪器验证。5.4.1.13 排除ROI校准故障问题/症状可能原因行动ROI校准失败样本块可能位于降1.如果 ROI Inspector 的 CCD Control/Settings 显示“B

36、lockROI图像模糊低的位置。Up”，则单击Block Up将样本块开CCD dWSglF EwiwTvMimH -JL " CctmX157"， 二 W |匚M we响的S flCTI* F A2.检查确认受热的盖组件已被全程向前拉出,以确保托盘可以被正确推入。如果 7500 Instrument安装了受热盖栓，检查确认盖栓处于锁定位置。3.如果ROI校准仍然失败， 检查7500 Instrument内的卤素灯状态（参阅5.3.3.1 “监控灯具状态”），然后，如果需要时,更换灯具（参阅5.3.4.3 “更换卤素灯”）。5.4.2 背景校准5.4.2.1 全程戴上一次性

37、无粉手套操作。5.4.2.2 从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出准备好的背景反应板。5.4.2.3让背景反应板温度上升温（至少需要5分钟）。5.4.2.45.4.2.5振荡反应板5秒钟。5.4.2.6用板式离心机将反应板离心 2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认反应板每个背景反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。5.4.2.7按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐。以一定角度向托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。（注：如果无法打开托盘,从包装袋中取出背景反应板。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若将背景

38、反应板贮存在其原始包装套内，背景反应板最多可重复使用三次。样本块可能位于其"升高”位置，锁定了托盘门位置。要降低样本块，选才I Instrument Calibrate , 然后退出 ROI Inspector。）5.4.2.8 在 7500 Software 中，选择 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 中，选择 Background 选项卡。在 Background 选项卡中，单击 Start Calibration 。5.4.2.9 按照向导的指示，完成校准。

39、Background Calibration对话框显示四个选项卡：? Overview -显示校准相关信息。? Setup -显示背景校准设置说明。单击 Next提示可以打开 Run选项卡。? Run -单击 START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击 Next提示可以打开 Analysis选项卡。? Analysis -指明校准状态（Passed/Failed）。如果校准失败，请参阅5.4.2.12“排除背景校准故障”。注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。5.4.2.10 校准完成后，取出校准反应板：按压托盘门，将其打开。取出

40、校准反应板。按压托盘门，使其滑入仪器。5.4.2.11 将校准反应板放入其包装套内，并将包装好的反应板放回冷冻柜内的光谱校准套件中。（重要！不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在初次打开其包装后最多可重复使用反应板3次。）5.4.2.12 排除背景校准故障问题/症状可能原因行动背景校准失败1背景反应板上的一个或多1.使用相同的背景反应板重复执行校准。个反应孔产生的光谱超过2.若校准再次失败，请使用另一不同的背景反收器的最高限度。1应板重复执行校准。1|3.若校准再次失败，请按卜义“如何确定污染” 的说明，确定污染源。5.4.2.13 如何确定污染若信号超过正常背景荧光的限度

41、，则表明校准反应板或样本块上存在荧光污染物。常见污染物 包括记号笔中残存的油墨、一次性手套洒落的粉末及灰尘。欲确定污染来源和位置：在查看原始数据时，选择反应板布局中数块连续的较小区域，以找出受污染反应孔的位置。将背景反应板旋转 180。，然后再次执行背景校准。重复步骤以找出污染物的位置。如果步骤和中找到的包含污染物的反应孔位置：?相同-则表明样本块中含有污染物。请按照“5.3.4.1样本块污染清除”的说明，除去样本块中的污染物。?相反-则表明背景反应板中含有污染物。丢弃当前使用的背景反应板，并使用新背景反应板执行背景校准程序。如果更换背景反应板并且取出样本块的污染后校准失败：将用黑纸覆盖白反应

42、板装入7500 Instrument 。按照本章的说明，执行背景校准程序。校准完成后，选择反应板布局中的所有反应孔。查看光谱图谱中的峰值。如果峰值：?可见-则表明7500 Instrument的光学部件可能已被污染。请与生产商联系。?不存在-则表明样本块已被污染。请按照“5.3.4.1样本块污染清除”的说明，除去样本块中的污染物。5.4.3 光学校准5.4.3.1 全程戴上一次性无粉手套操作。5.4.3.2 从贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中取出ROI校准反应板。5.4.3.3 让ROI校准反应板温度上升至室温（至少需要5分钟）。5.4.3.4 从包装袋中取出 ROI校准反应板，振荡反应板5秒钟

43、。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若将ROI校准反应板贮存在其原始包装套内，ROI校准反应板最多可重复使用三次。）（如果执行ROI校准后，将ROI校准反应板保持在室温，则跳到步骤 5.4.3.5 ,以减少在反应板在室温时形成的冷凝。如果ROI校准反应板位于冷冻柜中，转至步骤 5.4.3.2。5.4.3.5 用板式离心机将反应板离心2分钟。ROI校准反应板必须充分混合并离心。确认 ROI校准反应板每个反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。5.4.3.6 按压托盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐。以一定角度向

44、托盘右侧施加压力，从而关闭托盘门。5.4.3.7 在 7500 Software 中，选择 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 中，选择 Optical 选项卡。在 Optical 选项卡中，单击 Start Calibration 。5.4.3.8 按照向导的指示，完成校准。Optical Calibration 对话框显示四个选项卡:? Overview -显示校准相关信息。? Setup -显示光学校准设置说明。单击 Next提示可以打开 Run选项卡。? Run -单击

45、START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提示可以打开 Analysis选项卡。? Analysis -指明校准状态（Passed/Failed）。如果校准失败，请参阅 5.4.2.12“排除背景校准故障”。注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。5.4.3.9 取出校准反应板：按压托盘门，将其打开。取出校准反应板。按压托盘门，使其滑入仪器。5.4.3.10 将校准反应板放入其包装套中。将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。（重要！不要丢弃校准反应板。如果将反应板装在其原始包装套内贮存，在打开其包装后最多可

46、重复使用反应板 3次。）5.4.4 染料校准5.4.4.1 全程戴上一次性无粉手套操作。5.4.4.2 从冷冻柜中取出光谱校准套件，并从套件内取出所有染料反应板。5.4.4.3 将光谱校准套件放回冷冻柜贮藏。5.4.4.4 让染料反应板温度上升至室内温度（约需 5分钟）。（重要！在立即运行之前，请勿从包装袋内取出染料反应板。在每个染料反应板上，反应孔中的荧光染料具有光敏感特性。长时间暴露在光线中会降低反应板的荧光信号强度。）注：如果将7500 Real-Time PCR Instrument染料反应板贮存在其原始包装内并放在冷冻柜中，则在打开包装后 6个月内可以校准 7500 Real-Tim

47、e PCR Instrument 最多3次。5.4.4.5 在 7500 Software 中，选择 Instrument fInstrument Maintenance Manager 。在 Instrument Maintenance Manager 中，选择 Dye 选项卡。在 Dye 屏幕上，选择 System Dye Calibration 。 单击 Start Calibration 。5.4.4.6 按照向导的指示，完成每个反应板的校准。（重要！在每个校准中，向导将单独指示。必须独立设置、运行和分析每个染料反应板。）Dye Calibration对话框显示四个选项卡： ? Ove

48、rview -显示校准相关信息。当软件提示获取需要的材料时，选择要校准的染料。? Setup -显示染料校准设置说明。单击Next提示可以打开 Run选项卡。当软件提示装入染料反应板时，按照步骤 5.4.4.10所述准备并装载反应板。? Run -单击 START RUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击 Next提示可以打开Analysis选项卡。? Analysis -指明校准状态（Passed/Failed）。当软件提示分析从每个染料反应板采集的光谱时， 核实校准的状态：? Passed 7500 Instrument 校准通过。转到步骤 5.4.4.11 的。? Failed -75

49、00 Instrument校准失败。请参阅 5.4.4.15“排除染料校准故障”。注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。5.4.4.7 将软件所需的染料反应板从其包装中取出。振荡反应板5秒钟。（重要！不要丢弃存放反应板的包装袋。若贮存于原包袋中，反应板最多可重复使用3次。5.4.4.8 用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必须充分混合并离心。确认反应板每个背景反应孔中的液体均位于反应孔底部。如果不是，则以更长的时间离心反应板。5.4.4.9 检查并确保要装入的染料反应板与在7500 Software中选取的荧光匹配。5.4.4.10 按压托

50、盘门，将其打开。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器中被正确对齐。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。（注：如果无法打开托盘，样本块可能位于其"升高”位置，锁定了托盘位置。要降低样本块，选才? Instrument Calibrate , 然后退出 ROI Inspector 。）5.4.4.11 因为向导对每个染料校准单独提供指示，所以请对校准的每个染料执行以下程序。? Passed 7500 Instrument 校准通过。转到 b）。? Failed 7500 Instrument校准失败。请参阅 5.4.4.15 “排除染料校准故障”。核实染料

51、光谱的分组：a.在反应板布局中，选择反应板的孔。b.检查原始数据。对于每个光谱，请确认峰值：?位于7500 Instrument 的可检测范围内。?无不规格光谱峰值。?出现在染料的正确通道上。如果某光谱不符合上述标准，请参阅5.4.4.15“排除染料校准故障”。注：在含有相同染料的各反应孔中，光谱位置和峰值位置的差异是由于不同反应孔之间的光学属性及激发能存在细微差异而引起的。若所有光谱均可接受，则单击Next。5.4.4.12 取出校准反应板：（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100。C。若刚使用过仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。）按压托盘门，将其打开。取出校准反应板

52、。按压托盘门，将其关闭。将校准反应板放入其包装套中。将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。（注：如果将7500 Real-Time PCR Instrument染料反应板贮存在其原始包装内并放在冷冻柜中，则在打开包装后 6个月内可以校准 7500 Real-Time PCR Instrument 最多3次。)5.4.4.13 在按照指示将染料反应板取出后，单击 Finish 。5.4.4.14 按照5.4.4.1开始操作，准备并运行下一个反应板。滤光器ROX染料TEXAS RED 染料峰值(nm)染料/光谱-520JOE染料VIC染料-550-580FAM染料SYBR Gre

53、en 染料CY3染料NED染料TAMRA染料4-610CY5染料-6705.4.4.15排除染料校准故障问题/症状可能原因行动一个或多个原始光 谱达到或低于校准 的可检测阈值。?光谱校准反应板未充分离o?光谱校准反应板含有陈旧试1.卸载7500 Instrument 并查看光谱校准反应板的反应孔。若反应孔中的液体不是：-位于反应孔底部，请将反应板离心更长时间，剂或试剂体积不足。然后重复执行校准。?若止运行定制光谱校准反应-体积相等，则表明反应板未密封致使试剂挥板，染料可能浓度小足。发。请将其丢弃，并运行另一反应板。 一|2.若光谱校准反应板显示正常，则丢弃该反应板并运行另一块反应板。3.如果问

54、题依然存在，请与生产商联系。注：若止运行定制光谱校准反应板，请创建另一反应板但要增加产生不足信号的染料的浓度。1个或多个原始光1?样本块或光谱校准反应板含请按照5.4.2 “背景校准”操作，以确认是否存在谱超过 7500有荧光污染物。污染物。若背景校准未显示样本块含有污染物，则Instrument 的最高?若止运行定制光谱校准反应光谱校准反应板可能含有污染物。限量。板，染料可能浓度过大。光谱在一个以上的卜羊本块或光谱校准反应板含1注：若止运行定制光谱校准反应板，请创建另一反滤光器中含有峰 值。有荧光污染物。应板但要降低超过可检测限量的染料的浓度。5.4.5验证仪器性能5.4.5.1 全程戴上一次性无粉手套操作。5.4.5.2 冷冻柜中取出 TaqMan ? RNase P 96-Well Instrument Verification Plate ,然后让反应板温度上 升到室温（大约需要 5分钟）。5.4.5.3 从包装袋中取出 RNase P反应板。振荡反应板5秒钟。5.