液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用

1、1Agilent LC-MS/MS 6420内容1. LC-MS/MS的基本原理的基本原理2. 方法开发流程及优化方法开发流程及优化3. 电离影响因素与溶液化学电离影响因素与溶液化学4. 注意事项注意事项2022-1-221. LC-MS/MS的基本原理的基本原理2022-1-23ESI ion source42022-1-25Front-end ion optics2022-1-26Quadrupole2022-1-27Collision cell 2022-1-28HexapoleQuadrupole：ion focusingOctopole：ion transmissionN2 0.5

2、ml/minRear quadrupole and detector2022-1-29Pumping system102torr 10-2 10-3 10-5 torr torr torr2. LC/MS/MS 方法开发流程1 电离模式的选择2 查阅文献，参考样品前处理的技术路线和色谱分离条件、质谱参数条件等。3 MRM 参数优化 使用标准品优化 fragmentor 和collision energy4 离子源参数的优化（源温度、流速）5 LC分离方法的优化，1-3 min为理想2022-1-211MRM 参数优化o 扫描（MS2 Scan）2022-1-212选择离子监测（SIM）2022

3、-1-213优化毛细管出口电压（fragmentor），保证母离子的传输效率子离子扫描（Product Ion Scan）2022-1-214使用已优化好的fragmentor，选择定性定量离子，优化碰撞能量（collision energy），得到/优化子离子的响应，每个化合物一般选择两个强度最高的子离子，分别作定性离子与定量离子多反应监测（MRM）2022-1-215使用已优化好的 fragmentor 和collision energy，优化Dwell timeDwell time 优化2022-1-216Dwell time 优化2022-1-217Dynamic MRMo 标准MRM

4、对多组分，出峰时间波动，灵敏度低。o dMRM适合应用于多组分同时分析，自动优化分配Dwell Time，兼顾灵敏度与数据采集质量！2022-1-2182022-1-219the number of MRMs at any time are many fewer than with time segment methods, allowing much faster MS cycle times3. 电离影响因素与溶液化学o溶液的化学性质 流动相 被分析物 基质的性质o喷针 内部针的位置 针的状况 雾化气压力o高电压电极 毛细管和喷雾室电压设置 毛细管和喷雾室高压部件的状态 绝缘体的状态20离

5、子模式的选择o正离子ES模式 适合于碱性样品，amines，amides，aminoacids， antibiotics等 酸性流动相o负离子ES模式 适合于酸性样品，acids，hydroxyls，含强负电性基团 有杂原子，可失去质子。如COOH、OH 中性偏碱性流动相o可正可负 比较灵敏度2022-1-221溶剂匹配o 反相溶剂： 甲醇、乙腈、水o 兼容液质的盐（常用）： 甲酸、乙酸(0.01-1%)、甲酸铵、乙酸铵(小于20 mM)o 慎用：三氟乙酸等o 不兼容盐 硼酸盐、硫酸盐、磷酸盐（不挥发或易形成离子对）2022-1-222流动相中添加剂o 正离子模式- 甲酸、乙酸和三氟乙酸（慎用

6、）o 负离子模式- 氨水o 正离子负离子- 甲酸铵或乙酸铵（不高于20 mM）2022-1-223电喷雾-离子对的形成 对正离子检测，由于离子对的形成，是溶液或气相中的离子中和！ M+H+ + A- M+H + A0 A=B,S,P 有利于中性产物 A=甲/乙酸盐 有利于生成带电物质o 离子对强度： B,S,P 三氟乙酸 乙酸盐，甲酸盐2022-1-224电喷雾-离子对的形成 对负离子，由于离子对的生成，使溶液或气相中的离子中和！ M-H- + C+ M-H + C0 C=Na,K,Li 有利于中性产物 C=NH4+ 有利于带电物质2022-1-225ESI:离子竞争机制o 表面竞争 被分析离

7、子与电解质离子转换为气相离子的竞争使被分析物相应降低。o 电荷竞争 OAc+AH+HOAc+A2022-1-2264. 注意事项o 使用0.22 um孔隙滤膜过滤o 流动相含水50%,适当提高干燥气体的流速和温度o 选择母离子：准分子离子，M+H+、M-H-优先，避免选择加和离子M+Na+,所需能量较低，灵敏度好。o 子离子的选择：高质量端的特征离子。2022-1-227气相离子的产生o 表面活性高（具低溶剂化能）的离子优先转移至雾滴表面，最终转变为气相离子-竞争机制o 应采用表面活性低的缓冲盐o 低浓度的挥发性的酸、碱及缓冲盐2022-1-228小结：流动相的考虑o 金属离子缓冲盐影响离子化

8、o 表面活性剂影响去溶剂化o 离子对试剂可以离子化，而导致高背景噪音o 强离子对试剂可与待测物反应，导致待测物不能离子化o TEA 干扰正离子模式(m/z102)o TFA 扰负离子模式(m/z113)o 增塑剂（邻苯二甲酸酯）背景干扰，(m/z149,315, 391)2022-1-229API质谱图的解释o 检测到的离子种类依赖于溶剂添加剂和分析所用的条件。2022-1-230正离子检测-M+H+ 酸性条件-M+Na+ ，M+K+-M+NH4+ 有铵盐缓冲盐-M+X+ X=溶剂或缓冲溶液中的阳离子-2M+H+ 高浓度时形成的二聚体离子-M+H+S+ 溶剂加合离子负离子检测-M-H- 碱性条件-M+X- X=溶剂或缓冲溶液中的阴离子-M-H+S- 溶剂加合离子名义分子量和平均分子量o 对于分子C6H3Cl3o 平均分子量为o 6(12.01115)+3(1.000797)+3(35.453)o MW=181.428o 6(12.000)+3(1.00078)+3(34.9989)=179.9990精确质量/单同位素质量o 180.