第三章固定化酶与固定化细胞

1、第三章-固定化酶与固定化细胞第三章固定化酶与固定化细胞第一节概述第二节固定化酶的性质及其影响因素第三节固定化酶的制备第四节固定化细胞第五节固定化辅酶和原生质体第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应 用第一节概述 什么是固定化酶？ 第一节概述.固定化酶的优缺点多次使用可以装塔连续反应优点：纯化简单提高产物质量应用范围广缺点：首次投入成本高大分子底物较困难第一节结束 点击返回 第二节固定化酶的性质及其影响因素一. 影响固定化酶性质的因素二. 固定化后酶性质的变化三. 评价固定化酶的指标一. 影响固定化酶性质的因素1 .酶本身的变化，主要是由于活性中心的 氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了 变化。

2、二. 固定化后酶性质的变化1. 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降2 .固定化对酶稳定性的影响稳定性提高（原因）3. pH的变化（原因）载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 催化反应的产物为酸性时，固定化 酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低固定化后酶稳定性提高的原因：a. 固定化后酶分子与载体多点连接。b. 酶活力的释放是缓慢的。c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。PH 对酶活性的影响：(1) 改变酶的空间构象(2) 影响酶的催化基团的解离(3) 影响酶的结合基团的解离(4) 改变底物的解离状态，酶与底物不能 结合或结合后不能生成产物。4. 最

3、适温度变化一般与游离酶差不多，但有些会有较 明显的变化。5. 底物特异性变化作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化既可作用于低分子底物又可作用于大 分子低物的酶特异性往往会变化。6. 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变 化(链接)米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 由于分配效应：P =Si微环境/S宏观环境Km'=Km/ p (表观米氏常数)(1)载体与底物带相同电荷，Si<S, p<1,Km' >Km|固定化酶降低了酶的亲和力。（2）载体与底物电荷相反，静电作用，Si>S，贝Up >1,Km'<Km三. 评价固定化酶的指标

4、：1. 酶活定义（IU）:在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底 物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。 计量单位2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA所具有的酶活 力单位品质的体现3. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。4. 操作半衰期：连续测活条件下固定化酶活力下降为最 初活力一半所需要的时间（t 1/2 ） 衡量 稳定性的指标。5.6.或称偶联效率，活力保留百分数。5. 相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对 酶活力。四固定化酶的活力测定方法介绍1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶加入一定量的底物溶液，一边振

5、荡或搅拌，一边进行催化反应取出一定量的反应液进行酶活力测定。2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中让底物溶液以一定的流速流过酶柱收集流出的反应液测定其中产物的生成量或底物的消耗量。3. 连续测定法利用连续分光光度法等测定方法可以对固 定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定 化酶的酶活力。第二节固定化酶的性质及其影响因素提要影响固定化酶性质的因素固定化酶的性质评价固定化酶的指标第二节结束点击返回第三节固定化酶的制备一. 一般方法及特点二. 酶的固定化方法一. 一般方法及特点1. 四大类方法：吸附法(包括电吸附法) 结合法(无机多孔材料) 交联法(双功能试剂) 包埋法(微胶

6、囊法)各类固定化方法的特点比较：2. 选择方法依据：(1) 酶的性质(2) 载体的性质(3) 制备方法的选择3. 固定化后酶的考察项目：(1) 测定固定化酶的活力，以确定固定化 过程的活力回收率。(2) 考察固定化酶稳定性2 )考察固定化酶最适反应条件酶的固定化方法（一）吸附法（二）结合法（三）交联法（四）包埋法（entrapping method ） 酶和细胞固定化示意图（一）吸附法1.物理吸附：禾I用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上2. 常用载体：（1）无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、 硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg 蛋白/克吸附剂（2）有机载体：淀粉、白蛋白等。一般

7、吸 附量几十毫克蛋白/克吸附剂 研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷（二）结合法1. 离子键结合法2. 共价键结合法1. 离子键结合法 概念常用载体:DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶 使用注意：pH离子强度、温度2. 共价键结合法（1）概念（2） 可以形成共价键的基团： 游离氨基, 游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基, 甲硫基，吲哚基，二硫键（3 ）常用载体：天然高分子、人工合成的 高聚物、无机载体（4）载体活化的方法A. 重氮法B. 叠氮法C. 烷基化反应法D. 硅烷化法E. 溴化氰法A.重氮法反应示意式如下A.重氮法目前在我们国内用的较多的载体是对氨基 苯磺酰乙基（ABSE纤维素、琼脂糖，

8、葡聚 糖凝胶和琼脂等该方法需要载体具有芳香族氨基A.重氮法反应式及原理A.重氮法例5'-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到四个5'-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院 上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于 工业生产的固定化酶）B叠氮法例用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰 蛋白酶，步骤如下： 酯化：CM纤维素先洗涤干燥，然后悬于 无水甲醇中，在冰浴中通入 HCI气体，进行 酯化反应；然后洗涤，空气干燥。 肼解。把酯化后的 CM纤维素悬于甲醇 中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过 滤，洗涤干燥。叠氮化。肼解后的CM纤维素（1g）加入 150ml 2

9、% HCI在冰浴中混合，搅拌滴加 9m 3%NaNO反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤， 同时加酶（4）偶联。经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5C 搅拌2-3小时，过滤，用0.001N HCI，水 洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）C. 烷基化反应法D. 硅烷化法一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。多孔玻璃特点： 机械强度好，表面积大。 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再 生，寿命长等。D.硅烷化法D.硅烷化法D.硅烷化法E 溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNB）活化多糖类物 质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等.（三）交联法概念：借助双功能试剂使

10、酶分子之间发生交 联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。 用处：可用于含酶菌体或菌体碎片的固定 化。（三）交联法的形式交联法有2种形式： 酶直接交联法酶 辅助蛋白交联 双重固定法（1）吸附交联法（2）交联包埋法 酶直接交联法 概念：在酶液中加入适量多功能试剂，使其 形成不溶性衍生物。影响因素：固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液 pH 和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。 酶辅助蛋白交联概念：为避免分子内交联和在交联过程中因 化学修饰而引起酶失活，可使用第二个 “载 体"蛋白质（1）吸附交联法概念：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球 状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上， 再用戊二醛等双

11、功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化 酶。（2）交联包埋法概念：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结 成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖 一类物质进行包埋成颗粒。优点：这样避免颗粒太细的缺点，同时制得 的固定化酶稳定性好。（四） 包埋法（entrapping method ） 定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使 酶固定化的方法称为包埋法。（四）包埋法 包埋法分为网格型和微囊型1.网格型2 微囊型1.网格型概念：将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格 中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型 包埋法。也称为凝胶包埋法。2 微囊型包埋法是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小 球内，制

12、成固定化酶。由于固定化形成的酶 小球直径一般只有几微米至几百微米，所以 也称为微囊化法。微囊化法制备固定化酶有两种方法 界面沉淀法 界面聚合法 界面沉淀法这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚 物在水相和有机相的界面上溶解度较低而 形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失 活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很 麻烦。 界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界 面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹 起来。界面聚合法第三节提要一般方法及特点酶的固定化方法 第三节结束 点击返回第四节微生物、植物和动物细胞固定化 细胞特性比较概念：固定在载体上并在一定的空间范围内进行 生命活动的细胞称为固定化

13、细胞 该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代 谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。 细胞固定化方法吸附法 包埋法 吸附法 它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细 胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和 氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。影响吸附法的主要因素（1）Z-电位：Z-电位能近似地代表表面电 荷密度的大小(2 )细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁 的电荷性质(3) 载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无 机材料包埋固定法包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生 化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合 物颗粒(或膜)内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内 多酶系统的活力，可象游离细胞

14、那样进行产 物的发酵生产。包埋法分类常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺常用凝胶包埋法通过改变载体溶液参数包埋细胞改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和 溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态， 将细胞包埋其中。研究热点光交联树脂包埋法例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨 酯预聚物等，加入19左右的光敏剂，加水配 成一定浓度，加热至50 C,然后与一定浓度 的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄 层，用紫外照射3min，就可制得 固定化细胞的目的微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩 短了发酵生产周期植物细胞动物细胞第四节固定化细胞提要特点方法目的第四节结束点击返回第

15、五节固定化原生质体和辅酶一原生质体固定化的方法制备原生质体 将原生质体重新悬浮在 含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质 体悬浮液 包埋法固定化原生质体。关键：原生质体如何制备？二原生质体的制备将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的咼渗缓冲液中去细胞壁一一分离纯化一一得到原生质体-活性鉴 三酶解注意要点1酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到 细胞器中去。采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细 胞壁的成分合成，可以使酶插入。一般加入：巯基乙醇，Trito n-100,甘氨酸、 青霉素。三酶解注意要点2 酶系选择：溶菌酶蜗牛酶3葡聚糖酶纤维素、半纤维素、和果胶酶3 酶浓度选择（0.5%-1%

16、三酶解注意要点4酶解温度和pH5酶解终点确定四稳定剂（高渗溶液）要求1加入的化合物对细胞和原生质体无毒性2不会影响水解酶的活性3对代谢产物无不良影响 四稳定剂加入操作注意点1 一定pH （酶和菌体活性最高）2 一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱 缩）3种类：无机盐-对细菌有机物糖和糖醇-酵母4易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分 解的物质不宜作为稳定剂五原生质体细胞活性的检测1荧光素双醋酸盐（FDA）染色法2酚藏花红染色法3伊文思兰染色法四辅酶固定化1原因有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参 与酶的催化反应（递氢、递电子或递某些化 学基团的作用）有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能 自行

17、再生有机辅因子价格昂贵工业上应用全酶的关键是有机辅因子 的保留和再生辅酶固定化的方法：2固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰 法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶 联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超 滤器中。3辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间 传递的障碍。策略：先在辅酶的一定部位进行修饰-引入 功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物） -再 与水溶性高分子结合辅酶的固定化辅酶的固定化辅酶再生的形式：第五节固定化原生质体和辅酶的固定化原生质体辅酶固定化第五节结束点击返回第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应 用酶反应器介绍酶反应器的选择和应用 固定化酶和细胞的应用 生物催化反应器工程 一酶反应器。分批

18、搅拌反应器。 搅拌罐型连续流搅拌桶反应器。 固定床型（填充床反应器） 流化床反应器 连续搅拌桶-超滤反应器 循环反应器 膜式反应器 鼓泡塔型分批搅拌反应器反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小 规模试验连续流搅拌桶反应器 连续搅拌釜式反应器填充床反应器 旋转填充床 流化床反应器与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的 颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，而 是底物向上流过固定酶床，因此流速要适当 控制。循环反应器高效内循环生物反应器（HCR连续搅拌桶-超滤反应器膜式反应器定义：由膜状或板状固定化酶或固定化微生物组 装的反应器均称为膜式反应器。类型：扩散型膜反应器； 多相酶膜反应器。鼓泡塔型反应器

19、适用对象：反应中涉及气体的吸收或产生时 适用。气体进入方式：与底物一起从底部进入，经过气体分散板分 散。和循环液从底部以切线方向进入 生物催化反应-分离耦合反应器 反应分离耦合反应器成功实现产物在线分离产物在线分离策略实现头孢克罗半连续制 备减压式反应器用于生物催化反应中易挥发 产物的在线去除反应器选择 酶的形式：溶液酶颗粒状或片状固定化酶膜状和纤维状固定化酶底物的物理性质：溶解性、颗粒物质和胶体 物质反应操作要求 酶的稳定性应用和可塑性和成本酶反应器的应用控制酶反应器液态流动方式反应器中流动方式的改变会使酶与底物的 接触不良，造成反应器生产能力降低。流动方式改变造成反混程度的变化，会发生 程

20、度不同的反应或副反应。物料粒子进入反应器后所经历的时间称为 粒子的年龄。粒子离开反应器时的年龄称为 停留时间。反应器内不同年龄的粒子间的混合称为反 混。酶反应器的应用酶反应器对底物恒定转化目的：反应器能平稳的进行工作，有利于实 现自控操作方法：控制底物流速国外热点：将固定化酶反应器串联或并联操 作。酶反应器的应用保持酶反应器的稳定性：防止酶变性、中毒、自溶或载体磨损。 防止酶反应器中微生物污染向底物中加入杀菌、抑菌物质，或有机溶剂 底物物料预先除菌在45度以上环境中或酸、碱缓冲液中进行 反应酶反应器每次用后消毒一固定化酶（细胞）的应用1.固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用2.固定化酶在医药治

21、疗上的应用3.固定化酶在分析化学中应用4.固定化酶和亲和色谱5.固定化酶与环境保护6.新能源开发中的应用7固定化酶在基础理论研究中应用1.固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用 葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定 化。葡萄糖异构酶葡萄糖果糖果葡糖浆固定化酶在工业生产中的应用 聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工 业化生产L-苹果酸利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶 固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种 酒类固定化原生质体的应用研究中：固定后化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸 酶，使原来存在于细胞中的碱性磷酸酶，

22、全 部分泌到发酵液中，提高产率 36%可连续 使用37天。2. 固定化酶在医药治疗上的应用例1固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就既可以催化青霉素或头抱菌素水解生 成6-氨基青霉烷酸酸或7-氨基头孢霉烷酸 也可以催化6-APA或7-ACA与其他的羧酸衍 生物进行反应合成新的具有不同恻链基团的青霉素或头 孢霉素青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素 青霉素酰化酶催化合成头抱类抗生素酶促合成头抱类抗生素-Reversible reacti on-Hydrolysis of substrate or product by biocatalyst-Difficulty of separation of product from reacta nts固定化酶在医药治疗上的应用例2:制造人工肾利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成 的体外循环装置，大大提高了疗效。固定化 脲酶由酶与离子交换树脂一起制成微小胶 囊尿酶可分解尿素为 NH和CQ, NH3被树脂 吸附，CO可由肺部排出，活性炭用以吸附尿 素以外的代谢废物。3. 固定化酶在分析化学中应用酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电 量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自 动分析。酶电极 酶电极 特点：快速、方便、灵敏、精确 范围：糖类