分光光度计和流式细胞仪介绍

1、吸光分光光度计吸光分光光度计 在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法的分析方法称为吸光光度法, ,主要有主要有: : 红外吸收光谱：红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围分子振动光谱，吸收光波长范围2.5 1000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围200 400 nm（近紫外区）（近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量分析。，可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收

2、光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围400 750 nm ，主要用于有色物质的定量分析。，主要用于有色物质的定量分析。 紫外可见吸收光谱紫外可见吸收光谱 1 1光的基本性质光的基本性质 光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长波长 、频率、频率 、光速、光速c、波数（、波数（cm-1）等参数来描述：）等参数来描述： = c ； 波数波数 = 1/ = /c 光是由光子流组成，光子的能量：光是由光子流组成，光子的能量： E = h = h c / （Planck常数常数：h=6.626 10 -34 J S ) 光的波长越短（频率越高），

3、其能量越大。光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光白光(太阳光太阳光)：由各种单色光组成的复合光：由各种单色光组成的复合光 单色光单色光：单波长的光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成由具有相同能量的光子组成) 可见光区可见光区：400-750 nm 紫外光区紫外光区：近紫外区：近紫外区200 - 400 nm 远紫外区远紫外区10 - 200 nm （真空紫外区）（真空紫外区） 2. 2. 物质对光的选择性吸收及吸收曲线物质对光的选择性吸收及吸收曲线M + 热M + 荧光或磷光 E = E2 - E1 = h 量子化量子化 ；选择性吸收；选择性吸收; 分子结构的复杂性使其对分子结构的

4、复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；不同波长光的吸收程度不同； M + h M *基态基态 激发态激发态E1 （E） E2吸收曲线的讨论：吸收曲线的讨论：（1）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似状相似max不变。而对于不同物质，它们的吸不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和收曲线形状和max则不同。则不同。 （2）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。之一。 （3）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在有

5、差异，在max处吸光度处吸光度A 的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。光的吸收定律光的吸收定律朗伯朗伯比耳定律比耳定律 布格布格(Bouguer)(Bouguer)和朗伯和朗伯(Lambert)(Lambert)先后于先后于17291729年和年和17601760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A Ab b 18521852年比耳年比耳(Beer)(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。浓度之间也具有类似的关系。A A c c 二者的结合称为

6、朗伯二者的结合称为朗伯比耳定律比耳定律朗伯朗伯比耳定律数学表达式比耳定律数学表达式 Alg（I0/It)= b c 式中式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度：液层厚度(光程长度光程长度)，通常以，通常以cm为单位；为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位：溶液的摩尔浓度，单位molL； ：摩尔吸光系数，单位：摩尔吸光系数，单位Lmolcm； 或或: Alg（I0/It)= a b c c：溶液的浓度，单位：溶液的浓度，单位gL a：吸光系数，单位：吸光系数，单位Lgcm a与与的关系为：的关系为： a =/M （M为摩尔质量）为摩尔质量） 透光度透

7、光度( (透光率透光率) )T T透过度透过度T : 描述入射光透过溶液的程度描述入射光透过溶液的程度: T = I t / I0吸光度吸光度A与透光度与透光度T的关系的关系: A lg T 朗伯朗伯比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；依据。应用于各种光度法的吸收测量；流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念 流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, Flow Cytometry, 简称简称FCMFCM）是一种）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直可以快速、准确、客观，并且能够同时检测

8、快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分同时可以对特定群体加以分选选。散射光信号散射光信号 当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束 方向同轴的称前向角散射光信号（方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为）。与激光束垂直的称为 侧向角散射光信号（侧向角散射光信号（SSC）。）。散射光信号散射光信号Right Angle Light Right Angle Light Detecto

9、r Detector Cell Complexity Cell ComplexitySSCSSCForward Light Forward Light Detector Detector Cell Surface Area Cell Surface Area FSC FSCIncident Incident Light Light SourceSource外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后） 颗粒杂质、气泡颗粒杂质、气泡对检测的影响对检测的影响荧光信号荧光信号 使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光样本制备荧光样本制备双色直接染色双色直接染色数据存储数据存储 FCS 2.0格式格式 常以列表