色谱分析第7章毛细管电泳

1、LOGO第第7 7章章 毛细管电泳毛细管电泳Capillary Electrophoresis内容提要内容提要 概述概述 HPCE的基本原理的基本原理电泳、淌度、电渗电泳、淌度、电渗 毛细管电泳仪毛细管电泳仪 毛细管电泳的分类毛细管电泳的分类毛细管区带电泳毛细管区带电泳 (CZE)毛细管等速电泳毛细管等速电泳 (CITP)毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱 (MEKC)毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 (CGE)毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 (CIEF)2概述概述毛细管电泳毛细管电泳(capillary electrophresis, CE)，又称高效毛细管电泳，又称高效毛细管电泳(high p

2、erformance capillary electrophresis, HPCE)以毛细管毛细管为分离通道，以高压直流电高压直流电场场为驱动力，以样品的多种特性多种特性(电荷、电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、相大小、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等分配特性等)为根据的液相微分离分析微分离分析技术。3发展简史发展简史1981 75m内径的毛细管1984 毛细管胶束电动色谱1987 毛细管等电聚焦1988-1989 CE商品仪器1989 第一届国际毛细管电泳会议4概述概述分离的一般过程分离的一般过程分离方法分离方法 萃取、沉淀结晶、升华蒸馏、过滤、降沉、离心、色谱、电泳、筛分分离的特点分

3、离的特点 混合的逆过程 需外力的推动 不同组分差速运动过程5概述概述数学描述数学描述差速运动过程差速运动过程定时分离定时分离 L = vtR 例如 薄层色谱定长分离定长分离 tR = L/v 例如 HPLCGCCE6概述概述电泳电泳(electrophoresis, EP) 在电解质溶电解质溶液中液中，带电离子在电场电场作用下，向着与其电性相反相反的电极移动，称为电泳。1807年年，由俄国莫斯科大学的斐迪南弗雷德里克罗伊斯最早发现。7概述概述利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术电泳技术。1936年，瑞典学者蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪 ，分离了马血清白蛋白的3种球

4、蛋白，创建了电泳技术。获1948年诺贝尔化学奖。8概述概述由经典电泳到高效毛细管电泳由经典电泳到高效毛细管电泳经典电泳经典电泳 操作繁琐；分离效率低，无法与其它分离方法相比1981年年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行分析，柱效理论塔板数高达40万/米，开创高效毛细管电泳时代。从此电泳发生根本变革，发展成为可以和HPLC、GC相媲美的分析技术。9概述概述 毛细管毛细管 数据处理数据处理 电极电极 检测器检测器 电极电极 试样试样 缓冲液缓冲液 缓冲液缓冲液 高压电源高压电源 (可高至可高至30KV) 主要部件主要部件 高压电源、毛细管、检测器和缓高压电源、毛细管、检

5、测器和缓冲液贮瓶冲液贮瓶10概述概述技术改进技术改进 采用0.05mm内径的毛细管 采用高达数千伏的电压两者互相促进两者互相促进 毛细管的采用可使产生的热量较快的散发，大大减少温度效应，从而使电压可以很高 高电压可使电场推动力增大，进一步使柱子直径变小，柱长增加通常，通常，HPCE的柱效高于的柱效高于HPLC11概述概述与与HPLC相比，相比，HPCE具有以下优点具有以下优点 柱效高柱效高(105至至107理论塔板理论塔板)，灵敏度高灵敏度高(10-19 mol) 所需样品量少所需样品量少(10-9 L) 分析快速分析快速(几十秒几十秒)、分析成本低分析成本低 仪器简单，操作方便，容易实现自动

6、化仪器简单，操作方便，容易实现自动化不足不足 由于样品进样量少，HPCE一般不适用于一般不适用于样品的分离制备；重现性不如样品的分离制备；重现性不如HPLC。12概述概述电泳电泳与与电渗电渗电泳电泳 electrophoresis 是指在是指在电解质溶液电解质溶液中，中，带电粒子在带电粒子在电场电场作用下，以不同的速度向所作用下，以不同的速度向所带电荷带电荷相反相反的方向发生迁移的电动现象。的方向发生迁移的电动现象。电渗电渗 (eletroosmosis) 是指在电场作用下，毛是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动液体沿固体表面移动的现象。的现象。HPC

7、EHPCE的基本原理的基本原理13电泳涉及的基本概念电泳涉及的基本概念有效长度有效长度 Ld(cm) 毛细管的入口端到检测器窗口的距离。迁移时间迁移时间 tm (min) 指一种溶质从毛细管的入口端到达检测窗口的时间。电泳迁移时间是一个可直接通过仪器测量的量。迁移速度迁移速度(v = Ld/tm) 迁移速度不同是电泳分离的基础14HPCEHPCE的基本原理的基本原理带电粒子以速度带电粒子以速度v在电场中移动，受到大小在电场中移动，受到大小相等、方向相反的相等、方向相反的电场推动力电场推动力和和摩擦阻力摩擦阻力的作用。的作用。 电场力：电场力：FE = qE , 摩擦阻力摩擦阻力: F = fv

8、故故: qE = fv对于球形离子对于球形离子, f = 6r (-介质粘度介质粘度; r-半径半径)迁移速度迁移速度: v = qE/f = q/(6r)*E 若若 = q/(6r), 迁移速率迁移速率v与与直接相关直接相关 15HPCEHPCE的基本原理的基本原理淌度淌度 单位电场(E)下的电泳速度(v)称为淌度，也称为电迁移率。绝对淌度绝对淌度0em 在无限稀释无限稀释溶液中所测得的淌度。 毛细管有效长度毛细管有效长度迁移时间迁移时间毛细管总长度毛细管总长度电压电压淌度淌度 mobility = q/(6r), v = E淌度淌度 0em= v/E0em = v/(V/L) = (Ld/

9、tm)/(V/L) 16表征电泳速度表征电泳速度淌度淌度 mobility17有效淌度有效淌度em 由于活度活度特别是酸碱度酸碱度的不同，样品分子的解离度不同，电荷也将发生变化，所表现出的淌度会小于绝对淌度，称为有效淌度。淌度的含义淌度的含义(电泳速度的影响因素电泳速度的影响因素) ： 离子所带电荷越多，解离度越大，体积越离子所带电荷越多，解离度越大，体积越小，溶液的粘度越小则电泳速度越快。小，溶液的粘度越小则电泳速度越快。em = q/(6r)18电渗电渗 eletroosmosis1. 毛细管的材质为石英毛细管的材质为石英(二氧化硅二氧化硅)，在，在pH3的条的条件下，表面带有件下，表面带

10、有负电荷负电荷。2. 相应的，相应的，液体中正离子被液体中正离子被石英层负电荷吸引与石英层负电荷吸引与之相接触。上述正离子在电场作用下之相接触。上述正离子在电场作用下向负极移向负极移动动，最终，最终推动溶剂分子同向运动。推动溶剂分子同向运动。 电渗电渗 (eletroosmosis) 是指在电场作用下，毛细是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动液体沿固体表面移动的现的现象。象。 电渗流电渗流(electroosmotic flow, EOF) 在电场作用在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带

11、着溶剂一起向阴极迁移，便形相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流成了电渗流。电渗流电渗流方向方向样品分子样品分子泳动方向泳动方向电渗流的作用特点电渗流的作用特点1. 使液体沿毛细管壁均匀移动；使液体沿毛细管壁均匀移动；2. 使携带不同电性的分子均向负极移动、中使携带不同电性的分子均向负极移动、中性分子也随着电渗流一起移动。性分子也随着电渗流一起移动。带负电荷样品的电泳模式带负电荷样品的电泳模式1920电渗流的作用特点电渗流的作用特点电渗流电渗流塞流塞流谱带窄，柱效高谱带窄，柱效高HPLC层流层流谱带宽，柱效低谱带宽，柱效低电渗流的表示方法电渗流的表示方法 电渗流的大小可用电渗淌度电

12、渗流的大小可用电渗淌度(eo) 或电渗流系或电渗流系数表示数表示 eo = veo/E = Ld/(teo*E)21影响电渗流的因素影响电渗流的因素电渗流速度电渗流速度 毛细管毛细管有效长度有效长度电渗流电渗流流出时间流出时间 电场强度电场强度 221. 与与电场强度电场强度成正比，当毛细管长度成正比，当毛细管长度一定时，正比于一定时，正比于工作电压工作电压；2. 与与毛细管材料毛细管材料有关，不同材料表面有关，不同材料表面电荷特性不同，产生电渗流大小不电荷特性不同，产生电渗流大小不同。同。3. 与与电解质的电解质的pH值值、缓冲液的组成缓冲液的组成和和离子强度离子强度有关有关影响电渗流的因素

13、影响电渗流的因素23改变电渗流的方法改变电渗流的方法1. 改变外加径向电场改变外加径向电场2. 改变缓冲液的成分和浓度改变缓冲液的成分和浓度3. 改变缓冲液的改变缓冲液的pH4. 加入添加剂加入添加剂大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷，电渗流流向阳极。5. 改变温度改变温度 (通过改变粘度发挥作用通过改变粘度发挥作用)带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳电泳和电渗流电渗流二者的矢量和矢量和。在典型的毛细管电泳分离中，若有电渗存在典型的毛细管电泳分离中，若有电渗存在，在，离子的洗脱顺序离子的洗脱顺序是是: : 首先是最快的阳离子，紧接着是依次减慢的首先

14、是最快的阳离子，紧接着是依次减慢的阳离子；阳离子； ( (+ = 电渗流电渗流 + +ef ) ) 然后是全部的中性分子在一个区域出现；然后是全部的中性分子在一个区域出现；( ( 0 =电渗流电渗流 ) ) 最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快的阴离子。的阴离子。 ( (- = 电渗流电渗流 - -ef ) )24电渗流对迁移速率影响电渗流对迁移速率影响 电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象 电渗流的速度比电泳速度电渗流的速度比电泳速度快快5-7倍倍 利用电渗流可将正、负离子或中性分子利用电渗流可将正、负离子或中性分子一一起带向同一方向产

15、生起带向同一方向产生差速迁移差速迁移，在一次电，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析。泳操作中同时完成正、负离子的分离分析。 电渗流是毛细管电泳分离的重要参数，控电渗流是毛细管电泳分离的重要参数，控制制电渗流的大小和方向电渗流的大小和方向，可提高毛细管电，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。泳分离的效率、重现性、分离度。 25小结：电渗流的意义小结：电渗流的意义迁移时间迁移时间 t = L/v = L/(*E) = L2/(*V)柱效可以用理论塔板数柱效可以用理论塔板数n表示表示 n = ( em+ eo)V/(2D) n = 5.54(t/W )2 t为某一电泳峰的迁移时间为

16、某一电泳峰的迁移时间 W为电泳峰的半高峰宽为电泳峰的半高峰宽 理论塔板高度理论塔板高度 H = L/n 26HPCEHPCE的重要参数的重要参数电压越高电压越高, t越小越小电压越高电压越高, n越大越大分离度分离度电泳中两峰的分离度电泳中两峰的分离度(Rs)，也称为分辨率，它表示了也称为分辨率，它表示了淌度相近的组淌度相近的组分分分开的能力，可表达为分开的能力，可表达为-相邻两区带的迁移速度差相邻两区带的迁移速度差; 平平-两者的平均速度两者的平均速度/平平-分离选择性分离选择性; n-柱效柱效tm1、tm2 分别为两个组份的迁移时间分别为两个组份的迁移时间W 为峰底的宽度为峰底的宽度 27

17、HPCEHPCE的重要参数的重要参数Rs = (n1/2/4)(/平平)Rs = 2(tm2-tm1)/(W1+W2)28影响分离效率的因素影响分离效率的因素区带展宽区带展宽1.纵向扩散纵向扩散 在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽2 = 2Dt 纵向扩散由扩散系数扩散系数和迁移时间迁移时间决定。 大分子的扩散系数小，可获得更高的分离大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率。效率。2. 进样进样 进样长度越大，谱带展宽，内径越细越明显 需根据样品性质选择合适的进样方法以减少进样长度。影响分离效率的因素影响分离效率的因素区带展宽区带展宽3. 焦耳热与温度梯度焦耳热与温度梯度 电泳过程产生焦耳热，在

18、毛细管内形成温度梯度(中心温度高，则溶液粘度下降，速度加快)，破坏了塞流。 改善方法改善方法 减小毛细管内径；改善散热4. 溶质与管壁的相互作用溶质与管壁的相互作用 存在吸附与疏水作用，导致谱带展宽。 细内径的毛细管利于散热，但由于比表面积大，吸附尤其严重。 改善方法改善方法 加入两性离子以抑制吸附 毛细管毛细管 数据处理数据处理 电极电极 检测器检测器 电极电极 试样试样 缓冲液缓冲液 缓冲液缓冲液 高压电源高压电源 (可高至可高至30KV) 主要部件主要部件 高压电源、毛细管、检测器和缓高压电源、毛细管、检测器和缓冲液贮瓶冲液贮瓶30毛细管电泳仪毛细管电泳仪毛细管毛细管 毛细管是CE的核心

19、部件之一。早期研究集中在毛细管直径、长度、形状和材料方面，目前集中在管壁目前集中在管壁的改性和各种柱的制的改性和各种柱的制备。备。 管壁改性主要是消消除吸附除吸附和控制电渗流控制电渗流，通常采用动态修饰动态修饰和表面涂层表面涂层两类方法。 HPCE对检测器灵敏度要求相当高，故检测是CE中的关键问题。迄今为止除了原子吸收光谱与红外光谱未用于HPCE外，其它检测手段均已用于HPCE。检测器检测器 类型类型 检测限检测限/mol 特点特点紫外紫外-可见可见 10-1310-15 加二极管阵列，光谱信息加二极管阵列，光谱信息 荧光荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品需衍生灵敏度高，样品需衍生激光

20、诱导荧光激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品需衍生灵敏度极高，样品需衍生 电导电导 10-1810-19 离子灵敏，需专用的装置离子灵敏，需专用的装置毛细管电泳的分类毛细管电泳的分类毛细管区带电泳毛细管区带电泳 CZE 毛细管等速电泳毛细管等速电泳 CITP 毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱(MECC)毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 CGE 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 CIEF 33 CZE分离机理是基于各被分离物质的净电净电荷与其质量比荷与其质量比(荷质比荷质比)间的差异。CZE常用介质为电解质水溶液电解质水溶液，根据情况可加入不同有机溶剂或其它添加剂。迄今CZE仍是应用

21、最多的模式，应用范围包括氨基酸、肽、蛋白、离子、对映体拆分和其它带电物质的分离。34毛细管区带电泳毛细管区带电泳 CZECZE35-+0tm (min)36CZECZE电泳出峰顺序电泳出峰顺序以被分离物质的荷质比荷质比间的差异产生分离效果。对于正电荷正电荷，荷质比越大，t越小；对于负负电荷电荷，荷质比越大，t越大。所有中性物质中性物质的迁移率均与介质相同，因此无法分离无法分离。37CZECZE的分离特点的分离特点离子淌度离子淌度 与其所带电荷电荷q成正比，与粒子半径粒子半径r和溶液黏溶液黏度度成反比电渗流电渗流EOF pH值越高，EOF越大 盐浓度越高，EOF越小 温度升高，EOF加快，扩散快，分离效率降低38CZECZE