单克隆抗体制备的基本原理

1、单克隆抗体制备的基本原理一、单克隆抗体的概念抗体( antibody )是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的 免疫球蛋白。 常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生 的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质 成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体 也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。 即使是针对同一抗原决定 簇的常规血清抗体， 仍是由不同 B 细胞克隆产生的异质的抗体组成。因 而，常规血清抗体又称多克隆抗体( polyclonal antibody )，简称多 抗。由于常规抗体的多克隆性质， 加之不同批次的抗体制剂质量差异很

2、 大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定 抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦 寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein 建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞 融合，形成 B 细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像 骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死， 又能像脾 淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。 通过克隆化可得到来自单个杂交 瘤细胞的单克隆系， 即杂交瘤细胞系， 它所产生的抗体是针对同一抗原 决定簇的

3、高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体( monoclonal antibody ， McAb，简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供 应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次 * ，而且它在生 物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。德国科学家柯勒( Georges Ko1er )和英国科学家米尔斯坦( Cesar Milstein )两人由此杰出贡献而荣获 1984 年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术(一)杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发 展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基

4、因的研究、抗体结构 与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等， 为杂交瘤技术提供了必要 理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选 等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国自 然杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培 养”( Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity )的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤 细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤- 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guan

5、osine phosphoribosyl transferase， HGPR)T 的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。 融合由仙台病 毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌吟(hypoxanthine , H)、氨基喋 吟(ami nopterin , A)和胸腺嘧啶核苷 (thymidi ne , T)的培养基(HAT 中生长进行选择。 在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT,但不能连续培养，只能在培养基中存活几 天，而未融合的HGPRT骨髓瘤细胞和相互融合的 HGPRT骨髓瘤细胞不 能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞

6、因 得到分别来自亲本脾细胞的 HGPR和口亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性， 而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。 用这些细胞 系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹 水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久， 在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改 进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（ PEG的融合效 果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的 骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NS0/1都是既不合成轻链 又不合成重

7、链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针 对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞M0PC-2等的不足。再后来又建立了大鼠、 人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系， 但其基本原 理和方法是一样的。（二）杂交瘤技术的基本原理 细胞融合是一个随机的物理过程。 在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合 细胞悬中，经融合后细胞将以多种形式出现， 如融合的脾细胞和瘤细胞、 融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未 融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。 正常的脾细胞在培养基中存活 仅57天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合 的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。在细胞融

8、合后，要从上述五种细胞 中筛选出杂交瘤细胞，一般使用 HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有 次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成 有内源性途径 (主要途径 )和外源性途径 (旁路途径 )两种方式。 内源性途 径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合 成DNA而外源性途径则是利用次黄嘌吟或胸腺嘧啶在次嘌吟鸟嘌吟磷 酸核糖转移酶 (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase, HGPRT或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK) 的催化下来补救合成 DNAHAT培养基中氯基喋

9、吟是二氢叶酸还原酶的抑制剂 ，能有效地阻断 DNA合成的内源性途径。B淋巴细胞具有HGPRTT这两种酶，因此在内 源性途径被阻断后仍能利用 HAT培养基中的次黄嘌吟和胸腺嘧啶来合成 DNA可在HAT培养基中存活，但B淋巴细胞是正常细胞，故不能长期 存活。杂交瘤技术中所使用和 SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT的 TK- 缺陷型，缺乏HGPR酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行 DNA的 外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了 B淋 巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性， 能够合成HGPR酶和TK酶，故在HAT 养基中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在 HAT培养基中培

10、养两周 后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。三、单克隆抗体制备的方法与步骤 （一）单抗制备的基本流程单克隆抗体制备的主要步骤有：正常小鼠免疫处理；用物理、化学和生物方法促使细胞融合；杂交瘤细胞的筛选与培养；单克隆抗体 的提纯。（二）单克隆抗体制备的基本方法抗原提纯与动物免疫 对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。 如为细胞 抗原，可取1X 107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂 并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原， 可将抗原所在的电泳 条带切下，研磨后直接用以动物免疫。选择与所用骨髓瘤细胞同源的 BALB/C健康小鼠，鼠龄在812周，雌

11、 雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫 34 只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免 疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般23周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异 抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力） 也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后 3 4 天，分离脾细胞融合。骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是 Sp2/0 细胞株。 该细胞株生长及融合效率均

12、佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球 蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9X 105/ml，倍增时间通常为1015h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞 (活性应大于 95)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含 8- 氮鸟嘌呤的 培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为 2105/ml ，次日一般即为对数生长期细胞。在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融 合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞( feedercell )。 常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞， 制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠 腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含

13、小鼠腹腔细胞，其中在巨噬 细胞和其他细胞。 亦有用小鼠的脾细胞、 大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲 养细胞的。在制备饲养细胞时， 切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有 严重污染。饲养细胞调至1X 105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节， 基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释 PEG消除PEG勺作用。将融 合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。 融合过程中有几个问题应 特别注意。细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从 1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。 反应时间：在两种细胞的

14、混合细胞悬液中，第 1min 滴加 4.5ml 培养液； 间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。培养液的成分：对 融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养 成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。有限稀释法筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为 HAT敏感细胞株，所以只有融合的 细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一 般稀释至 0.8 个细胞 / 孔），按 Poisson 法计算，应有 36的孔为 1 个细胞/孔。细胞培养至覆盖0 %20%孔底时，吸取培养上清用ELISA 检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔

15、， 将孔中细 胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的 ELISA测定，选高分泌特异性细胞 株扩大培养或冻存。单克隆抗体的制备和冻存筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备， 因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方 法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单 克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于 单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c 小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射， 一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。 通常在接种一周后即有明显 的腹水产生，每只小鼠可收集

16、 510ml 的腹水，有时甚至超过 40ml。 该法制备的腹水抗体含量高， 每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此 外，腹水中的杂蛋白也较少， 便于抗体的纯化。 接种细胞的数量应适当， 一般为5X 105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好， 冻存于液氮的细 胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在-70 C冰箱则活性改变较快。 细胞 不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲亚砜（ DMS）O 是普遍应用的 冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在50%95%之间。如果低于50，则说明冻存复苏过程有问题。单克隆抗体的纯化 单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化， 腹水特异性抗体的浓度较 抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。 按所要求的纯度不同采用相应 的纯化方法。 一般采用盐析、 凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化