EDU细胞增殖检测

1、荧光显微镜检测方法（以 96 孔板，A549 贴壁细胞为例）细胞培养取对数生长期细胞，以每孔 4X1031 X105细胞接种于 96 孔板中，培养至正常生长阶段。 药物处理（可选）客户可以根据实验需要进行各种药物处理。EdU 标记1.1 用细胞培养基按 1000 : 1 的比例稀释 EdU 溶液（试剂 A），制备适量 50 側 EdU 培养 基；注：1）EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育（2h）宜采用高浓度（1050 凶），长时间孵育（24h）宜采用低浓度（110 側）;2）如果需配置 10 pM EdU 培养基，需调整为 5000 : 1 稀释比例；3）配置好的培养基的保存时间取决于培养

2、基的性质。表 1 EdU 培养基及染色反应液的使用量参考96 孔板*48 孔板24 孔板12 孔板6 孔板5.5 cm 小皿EdU 培养基100p150P200P300P500P2 mL染色反应液100p150P200P300P500P2 mL注：1）*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU 培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜；2）悬浮细胞 EdU 用量依据培养体积而定。1.2 每孔加入 100 山 50PM EdU 培养基孵育 2 小时，弃培养基；注：1）最佳孵育时间与细胞周期相关（表 2），大多数细胞系均可采用 2 小时孵育时间；2）EdU 培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU 孵

3、育时间内的营养物质持续供给（表 1）；1.3 PBS 清洗细胞 12 次，每次 5 分钟。注：清洗目的是将未渗入DNA 的 EdU 洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。表 2 EdU 孵育时间设定参考3T3HelaHEK293*细胞系人胚胎细胞酵母细胞人成纤维细胞人宫颈癌细胞人胚肾细胞系人神经细胞细胞周期30min3h18h21h25h5d孵育时间5min20min2h2h2h1d注：1)EdU 孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的 1/10 至 1/5，但大多数细胞系均可采用 2h 孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多；2)*考虑到细胞培养基、温度、

4、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞 群体细胞周期会有所变化。表 3 细胞实验 EdU 孵育浓度及时间参考PubMedIDReferenceCell lineConcentrationTime18272492Salic A, et al. PNAS . 2008NIH3T3, Hela10 nM10 gM1 hr18521918Cappella P, et al. Cytometry A . 2008HL-60,A2780,U2OS110gM30 min18996411Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods .2009Neurospheres120

5、gM24 hr19179371Limsirichaikul S, et al. Nucleic Acids Res.2009Primary fibroblasts10側1,2,4 hr19253396Warren M, et al. Dev Dyn . 2009Chick embryos10側2 mM4 hr19647746Yu Y, et al. J Immunol Methods . 2009Spleen cells50側24 hr19544417Momcilovi ? O, et al. Stem Cells . 2009Human ES cells10側30 min20080700Ci

6、nquin O, et al. PNAS . 2010emb-301 gM12 hr20025889Han W, et al. Life Sci . 2009VSMC50gM2 hr20659708Huang C, et al. J Genet Genomics . 2010ESC50gM2 hr21310713Hua H, et al. Nucleic Acids Res . 2011fissionyeaststrains10gM3 hr20824490Lv L, et al. Mol Cell Biochem . 2011EJ cells50gM4hr21248284Yang S, et

7、al. Biol Reprod . 2011GC cells50gM2 hr21227924Zhang YW, et al. Nucleic Acids Res . 2011U2OS, HT2930gM90 min21829621Guo T, et al. PloS One . 2011HIT-T1550gM4hr21980430Zeng T, et al. PloS One . 2011MCF-10A25gM2hr22012572Ding D, et al. Int Orthop . 2011C3H10T1/2104M24hr22000787Zeng W, et al. Biomateria

8、ls . 2011EPC504M4hr21913215Xue乙et al. J Cell Biochem . 2011SGC7901254M24hr22016038Peng F, et al. Lasers Med Sci . 2011MSC504M2hr21878637Li D, et al. J Biol Chem . 2011HCC504M2hr注：如果您有采用 BrdU 进行实验的经验，可以参照BrdU 实验的相关参数进行 EdU 实验。细胞固定化2.1 每孔加入 50 丄细胞固定液（即含 4%多聚甲醛的 PBS）室温孵育 30 分钟，弃固定液； 注：1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构

9、的保持，当需要抗体染色时，需采用 Triton X-100透化细胞以利于抗体进入细胞内。2）可采用其他方式进行细胞固定。2.2 每孔加入 50 丄 2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育 5 分钟后，弃甘氨酸溶液；注：目的是中和多聚甲醛，保证染色反应体系，当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤；2.3 每孔加入 100 山 PBS，脱色摇床清洗 5 分钟，弃 PBS ;2.4 （加强）每孔加入 100 山渗透剂（0.5% TritonX-100 的 PBS）脱色摇床孵育 10 分钟;PBS 清 洗 1次，5 分钟。注：当实验需要进行其他抗体染色时，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能

10、需要增强细胞膜通透性。普通细胞可以省略。Apollo 染色3.1 每孔加入 100 山的 1X Apollo ?染色反应液 俵 3），避光、室温、脱色摇床孵育30 分钟后，弃染色反应液；注：1）染色液用量与细胞量相关，以覆盖细胞为宜（表 1）；2）孵育时间可以进行适当调整，调整范围为1030 分钟。表 4 Apollo ?染色反应液的配置参考（现用现配）配制顺序Apollo?染色反应液500 pL*1 mL5 mL10 mL1去离子水469 丄938PL4.69 mL9.38 mL2Apollo?反应缓冲液（试剂 B）25 pL50此250 pL500pL3Apollo?催化剂溶液（试剂 C）

11、5 pL10此50 pL100pL4Apollo?荧光染料溶液（试剂D）1.5PL3 pL15 pL30 pL5Apollo?缓冲添加剂（试剂 E）5 mg9 mg44 mg88 mg注：1）*表示通常配制的 Apollo?反应液的体积足以进行 510 个孔（96 孔板）染色；2）按顺序配制适量 1X Apollo ?染色反应液，以免破坏正常的反应体系（现用现配，30 分钟用完）；3）试剂 E 为白色粉末，较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需更换；粉末较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过戈 0%。3.2 加入 100 山渗透剂（0.5% TritonX-100 的 P

12、BS）脱色摇床清洗 23 次，每次 10 分钟， 弃渗透剂；3.3 （加强）每孔每次加入 100 止甲醇清洗 12 次，每次 5 分钟；PBS 清洗 1 次，每次 5 分钟。 注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。普通实验可以省略。DNA 染色4.1 用去离子水按 100 : 1 的比例稀释试剂 F,制备适量 1X Hoechst33342 反应液，避光保 存；4.2 每孔加入 100 山 1X Hoechst 33342 反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30 分钟后，弃染色反应液；4.3 每孔每次加入 100 止 PBS 清洗 13 次；4.4 客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入 100 丄 PBS 保存待用。其他染色（自备）（可选）客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色（注：染料兼容性请参照表 4）。图像获取及分析建议染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光4C湿润保存待测，但不应超过3天。注：调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms 左右，尽量不要1s。表 5 配套染料的相关波长信息C