荧光定量PCR的原理及使用

1、荧光定量PCR的原理及使用荧光定量PCR (FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是： 1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入 双链DNA,或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得， 大大提高了检测的灵敬度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除 了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常 用的儿种检测方法：1、 双链DNA内插染料某些染料如SYBR Green I能选择性地与双链DXA结合，同时产生强烈荧光。在 PCR过程中SYBR Green I可与新合成的双链DNA结合，产生的荧

2、光信号与双链 DNA成正比。SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DA双链结合的荧光 染料。当它与DA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号 急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与 DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急 剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。S

3、YBR Green I荧光染料与DNA双链的结合SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设讣的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。2、TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3' -5'外 切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。山于探针与模板是特异性结合，所以 荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中, 包括一对PCR引物和一条

4、探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条 引物之间。探针的5端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等，3 端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,报告 基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行， Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5' -3外切核酸酶活性就会 将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所 以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和LI的片段一样，有一个同步指数增长的7过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。TaqMan®

5、探针TaqMan探针的荧光信号产生机制根据其3端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TdqHdn探针和 TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(NonFluorescent Quencher),本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连 接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10° C左 右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设汁得更短， 既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基 组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设讣。实验证

6、明，TaqMan MGB探 针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。非荧光淬灭基团Minor Groove BinderTaqMan MGB 探针探针设计一般应符合以下条件：1、探针长度应在20、40个碱基左右，以保 证结合的特异性。2、G、C碱基含量在40%-60%,避免单核昔酸序列的重复。3、 避免与引物发生朵交或重叠。4、探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板 结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5°C。3、 分子信标技术分子信标技术(molecular beacon)也是在同一探针的两末端分别标记 荧光分子和淬灭分子，与TaqMan探针不同的是该探针5

7、和3'末端自身可 形成一个8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不 会产生荧光。当溶液中有特异模板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针 的发卡结构即FRET消失，于是溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中模板 的量成正比，因此可用于PCR定量分析。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板 的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。1、双链DNA内插染料常用的是SYBR Gree

8、n I荧光染料，其技术原理：SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释 放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信 号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green 染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引 物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。荧光染料检测法一般主要是利用荧光染料(

9、如SYBR Green I)与双链DA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设讣荧光探针，无需特别 优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量PCR仪。荧光染料法实 质上是常规的PCR反应中添加了荧光染料，借助染料和双链DNA的结合所发出的荧 光实时监控反应的进程。山于不需要设计序列特异性探针和优化反应条件，价格 低廉，通用性强，而且荧光染料法可用于任何一种型号的定量PCR仪，因而同样 得到广泛采用。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBR荧光 染料掺入DNA双链后荧光信号显著增强；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来, 荧

10、光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物，SYBR Green染 料与双链产物结合，经检测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与PCR产物的增 加完全同步。荧光染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。 在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点， 定量PCR仪连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产 物会在不同的温度点解链。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所 测量。对溶解曲线进行微分可以讣算出洛解峰。溶解峰可以反映反应中扩增到的 产物，因此用溶解曲线数据就可以进行定量检测了。将强毒株H勺RNA模板做10倍倍比稀释后，用紫外分光光度计测定其浓度， 然后按下面的公式转换成模板的拷贝数：拷贝数二NDV模板浓度X阿氏常数/ (- 个碱基的平均分子量X