Exp.5AP比活性的测定

1、（AKP比活性测定）比活性测定）Exp. 5Specific activity assay of AKP目的要求目的要求1、学习酶的活性、比活性的测定方法；、学习酶的活性、比活性的测定方法；2、掌握酶的活性、比活性、得率、纯化倍数的概、掌握酶的活性、比活性、得率、纯化倍数的概念念Purpose1、Learn the method of the assay of enzyme activity and specific activity2、Master the concepts of enzyme activity, enzyme specific activity , yield and th

2、e folds of purification概念：概念：1、酶活性：、酶活性： 酶所具有的催化能力酶所具有的催化能力 (对特定化学反应对特定化学反应)。 本实验中本实验中, 酶活性单位是酶活性单位是AKP在在37下保温下保温15min产生产生1mg酚者为酚者为1个酶活性单位个酶活性单位酶活性单位：酶活性单位：2、酶的比活性：、酶的比活性：单位重量的单位重量的protein样品中所含酶活性的单位数样品中所含酶活性的单位数U/mg）。）。用来表示酶被纯化的程度用来表示酶被纯化的程度同一种酶，比活性愈高，表明酶愈纯。同一种酶，比活性愈高，表明酶愈纯。 3、纯化倍数：衡量纯化效果的指标、纯化倍数：衡

3、量纯化效果的指标 4、得率：评价一种纯化方案的指标、得率：评价一种纯化方案的指标 AKP比活性比活性=AKP活性单位数活性单位数/ml蛋白质蛋白质mg/ml）纯化倍数纯化倍数=各阶段比活性数各阶段比活性数匀浆液匀浆液A液比活性数液比活性数得率得率=各阶段酶的总活性单位各阶段酶的总活性单位匀浆液匀浆液A液中酶的总活性单位液中酶的总活性单位100%The expressions:O-P=OONaONa磷酸苯二钠磷酸苯二钠+H2OAKPOHHO-P=OONaONa+C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=OH3C-NOH+C6H5NH3C-NH3C-CC-N=C=OH3C-NOK3Fe(CN)6

4、OH-4-氨基安替比林氨基安替比林醌衍生物醌衍生物Principle （原理）（原理）1. 2. 注意：注意：准确保温准确保温15min15min从加第一种酶液开始计时）从加第一种酶液开始计时）充分混匀充分混匀吸取基质液和酶液量要准确吸取基质液和酶液量要准确Methods1. Activity assay of AKP (AKP 酶活性测定酶活性测定)比色时注意波长是比色时注意波长是500nm500nm还是还是510nm510nm1. Activity assay of AKPA1B1COs0.04mol/l base (ml)1.001.001.001.001.00TAE buffer（PH

5、8.8)（ml）0.800.800.801.000.90Hydroxybenzene standard solution（ml）00000.10mix up the solution, react at 37 for 5min Enzyme solution (ml)0.200.200.2000mix up the solution，time immediately， react at 37 for right 15min0.5mol/l NaOH (ml)1.001.001.001.001.000.3% 4-AAp(ml)1.001.001.001.001.000.5%K3Fe(CN)6(m

6、l)2.002.002.002.002.00 （酶活性测定）（酶活性测定） A1 B1 C O 标标酶活酶单位酶活酶单位/ml）= 0.10.1 稀释倍数稀释倍数OD测测OD标标10.2酚标准酚标准浓度浓度酚标准酚标准体积体积酶液酶液体积体积A A1 20倍倍B B1 10倍倍1、enzyme activity =510nm2. Quantitation of Proteins -The Lowry Method A2B1CO sEnzyme solution (ml)0.200.200.2000Standard protein（ml）00000.400.9%NaCl (ml)0.800.80

7、0.801.000.60Folin-A(ml)5.005.005.005.005.00mix up the solution, react at RT (room temperature) for 10 min Folin-B(ml)0.500.500.500.500.50 mix up the solution, room temperature for 30 min( 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定Lowry法法_) =500nmA2 B1 C O 标标蛋白浓度蛋白浓度mg/ml）= 0.1 稀释倍数稀释倍数OD测测OD标标10.2酶液酶液体积体积标准蛋标准蛋白的量白的量0.25mg/ml0.4ml=0.1mgA A2 80倍倍B B1 10倍倍 2. Quantitation of Proteins -The Lowry Method (结果结果)AKP比活性比活性=AKP活性单位数活性单位数/ml蛋白质蛋白质mg/ml）纯化倍数纯化倍数=各阶段比活性数各阶段比活性数匀浆液匀浆液A液比活性数液比活性数得率得率=各阶段酶的总活性单位各阶段酶的总活性单位匀浆液匀浆液A液中酶的总活性单位液中酶的总活性单位100%有效数字保留有效数字保留3位位ResultsThe