基因工程的下游技术重组蛋白的表达,纯化和分析ppt课件

1、基因工程的下游技术基因工程的下游技术 重组蛋白的表达、纯化和分析重组蛋白的表达、纯化和分析 重组蛋白的表达重组蛋白的表达表达体系：表达体系： 表达载体表达载体 原核原核 受体细胞受体细胞 真核真核选择表达载体常用的关键元件：选择表达载体常用的关键元件：启动子和调理序列表达强弱、细胞或启动子和调理序列表达强弱、细胞或组织特异性、表达调理等，如本实验的组织特异性、表达调理等，如本实验的乳糖支配子。乳糖支配子。交融基因纯化、标签，或加强蛋白可交融基因纯化、标签，或加强蛋白可溶性等。如多聚溶性等。如多聚His标签标签6His，便于，便于镍柱亲和层析纯化。镍柱亲和层析纯化。GST交融蛋白用交融蛋白用GS

2、T柱亲和层析柱亲和层析分泌信号分泌信号挑选标志挑选标志其它其它6His 重组蛋白的纯化重组蛋白的纯化亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析 本单元实验流程：本单元实验流程：细菌细菌pEF-GFPuv 亲和层析亲和层析IPTG诱导诱导细菌总蛋白细菌总蛋白重组蛋白交融蛋白重组蛋白交融蛋白乳糖支配子的特性乳糖支配子的特性SDS-PAGE初步分析初步分析实验目的实验目的实验原理实验原理资料与试剂资料与试剂实验仪器实验仪器操作步骤操作步骤本卷须知本卷须知实验安排实验安排思索与讨论思索与讨论实验目的实验目的了解和掌握了解和掌握IPTG诱导表达的原理。诱导表达的原理。了解降解物阻遏

3、的景象及其机理。了解降解物阻遏的景象及其机理。实验原理实验原理支配子是基因表达的协调单位。通常支配子是基因表达的协调单位。通常由由2个以上功能相关的构造基因以及个以上功能相关的构造基因以及一些调理序列如启动子序列、支配一些调理序列如启动子序列、支配序列等组成。序列等组成。乳糖支配子由三个构造基因乳糖支配子由三个构造基因Z、Y、A和支配序列、启动子、和支配序列、启动子、CAP结合位结合位点等调理序列组成。点等调理序列组成。 乳糖支配子的诱导表达乳糖支配子的诱导表达当没有乳糖存在时，调理基因当没有乳糖存在时，调理基因lacI表达，转录表达，转录的的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与支配翻译成阻遏蛋

4、白。阻遏蛋白与支配序列序列lacO结合，妨碍了结合在旁边启动子的结合，妨碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前挪动，使构造基因不能转录，聚合酶向前挪动，使构造基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖支配子处于妨碍形状。乳糖存在时，乳糖支配子处于妨碍形状。 乳糖支配子的诱导表达续乳糖支配子的诱导表达续当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改动，而不能结合到支配序列上，的构象发生改动，而不能结合到支配序列上，R

5、NA聚合酶可以从启动子向聚合酶可以从启动子向3端挪动，于是，端挪动，于是，构造基因可以转录出构造基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋，然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖支白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖支配子被诱导。配子被诱导。 乳糖支配子的诱导物是异乳糖。乳糖支配子的诱导物是异乳糖。IPTG是异是异乳糖的构造类似物。由于乳糖的构造类似物。由于IPTG不会被分解，不会被分解，它的诱导作用是耐久的。它的诱导作用是耐久的。 乳糖支配子的诱导表达续乳糖支配子的诱导表达续本实验所运用的表达载体上含有乳糖支配子本实验所运用的表达载体上含有乳糖支配子的调理序列，目的基由于绿色荧光蛋白基因

6、。的调理序列，目的基由于绿色荧光蛋白基因。在在IPTG的诱导下，目的基因表达可加强的诱导下，目的基因表达可加强105倍。然而，诱导表达经常遭到温度和诱导物倍。然而，诱导表达经常遭到温度和诱导物的影响。的影响。乳糖支配子的降解物阻遏乳糖支配子的降解物阻遏当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基中生长当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培育基中生长时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。只需当葡萄糖耗尽后，细菌才干充分利用乳只需当葡萄糖耗尽后，细菌才干充分利用乳糖，这种景象称葡萄糖效应，其本质是由葡糖，这种景象称葡萄糖效应，其本质是由葡萄糖降解物引起的阻遏作用，所以又称降解萄糖降

7、解物引起的阻遏作用，所以又称降解物阻遏物阻遏catabolic repression。乳糖支配子的降解物阻遏续乳糖支配子的降解物阻遏续降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白降解物阻遏的机理：代谢物基因激活蛋白Catabolite gene Activation Protein，CAP，又称，又称cAMP受体蛋白受体蛋白cAMP Receptor Protein，CRP属属于激活蛋白的一种，对乳糖支配子进展正调于激活蛋白的一种，对乳糖支配子进展正调理。理。 CAP分子内分别有分子内分别有DNA结合区和结合区和cAMP结合区。当结合区。当CAP与与cAMP结合后，就可结合结合后，就可结合到到CAP结

8、合位点上，促进转录。结合位点上，促进转录。 葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制转录。的浓度，抑制转录。 阻遏蛋白负调理与阻遏蛋白负调理与CAP正调理的协调正调理的协调 当阻遏蛋白封锁转录时，当阻遏蛋白封锁转录时，CAP对该系统不能对该系统不能发扬作用；而没有发扬作用；而没有CAP存在时，即使没有阻存在时，即使没有阻遏蛋白与支配序列结合，支配子仍无转录活遏蛋白与支配序列结合，支配子仍无转录活性。只需在性。只需在CAP存在且没有阻遏蛋白与支配存在且没有阻遏蛋白与支配序列结合

9、时，或者说只需高乳糖低葡萄糖时，序列结合时，或者说只需高乳糖低葡萄糖时，支配子发扬最大转录活性。支配子发扬最大转录活性。 这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。这种协调与细菌对碳源的优先利用相一致。The structure of lac operon调理序列调理序列构造基因构造基因Repressor and negative regulation异乳糖异乳糖异丙基硫代半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷异乳糖异乳糖CAP and positive regulation 低乳糖时低乳糖时 高乳糖时高乳糖时在协调调理下，在协调调理下，lac operon的强诱导作用发生在高乳的强诱导作用发生在高乳糖、低葡

10、萄糖的形状。糖、低葡萄糖的形状。资料与试剂资料与试剂资料资料 含含pUC18质粒工程菌及含质粒工程菌及含pGFPuv质粒工程菌。质粒工程菌。试剂试剂LB 液体培育基液体培育基 ： 蛋白胨蛋白胨tryptone10g、酵母粉酵母粉yeast extract5g、NaCl 10g，加，加800mL双蒸水溶解，双蒸水溶解，用用10M NaOH调调pH至至7.2-7.5，定容至定容至1000mL。 分装，高压灭菌，分装，高压灭菌，4保管。保管。氨苄青霉素溶液：氨苄青霉素溶液： 无菌双蒸水配成无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，分装，-20保管，运用终浓度为保管，运用终浓度为50g/mL或或100g/

11、mL。IPTG溶液：溶液： 将将238.3mg IPTG溶解于溶解于10mL双蒸水，双蒸水，0.22m细菌滤器过滤除菌，分装，细菌滤器过滤除菌，分装，-20保保管备用，储存浓度为管备用，储存浓度为100 mM。20%葡萄糖溶液：葡萄糖溶液： 20g葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至葡萄糖溶解于适量双蒸水，定容至100mL，121，15min 灭菌，灭菌，4保管。保管。实验仪器实验仪器 超净任务台、超净任务台、 恒温摇床、离心恒温摇床、离心机等。机等。操作步骤操作步骤挑取含挑取含pUC18质粒工程菌及含质粒工程菌及含pGFPuv质质粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄

12、青霉终浓度为终浓度为100g/mL，以下同，以下同)的的5mL的的LB培育基中，于培育基中，于37、250rpm过夜培育过夜培育12h-14h至对数生长期。至对数生长期。取取3支已灭菌的大试管，分别参与支已灭菌的大试管，分别参与5mL含含有氨苄青霉素的有氨苄青霉素的LB培育液，编号为培育液，编号为1#，2#，3#，另取一个，另取一个250mL的灭菌三角瓶，的灭菌三角瓶，编号为编号为6#，参与，参与50mL含氨苄青霉素的含氨苄青霉素的LB培育液。培育液。 1#：接：接50L空载工程菌含空载工程菌含pUC18过夜培过夜培育物，育物，25-28培育培育10 h-12h； 2#：接：接50L重组菌含重

13、组菌含pGFPuv过夜培过夜培育物，育物，25-28培育培育10 h-12h； 3#：接：接50L重组菌含重组菌含pGFPuv 过夜培过夜培育物，育物，37培育至培育至O.D600约为约为0.5约约3h-4h)，然后参与然后参与20%葡萄糖葡萄糖50L至终浓度为至终浓度为0.2%，及及100mM IPTG 5L至终浓度为至终浓度为0.1mM，25-28培育培育8h-10h或过夜；或过夜； 6#：接：接500L重组菌含重组菌含pGFPuv过夜过夜培育物，培育物，37培育至培育至O.D600约为约为0.5约约3h-4h)，然后只参与，然后只参与100mM IPTG 50L至终浓至终浓度为度为0.1

14、 mM，25-28培育培育8h-10h或过夜。或过夜。4. 搜集菌体。分别将搜集菌体。分别将1#-3#全部培育物搜集到全部培育物搜集到三个三个7mL离心管中，编上相应编号，离心弃上离心管中，编上相应编号，离心弃上清；三角瓶培育的清；三角瓶培育的50mL菌液混匀后取菌液混匀后取5mL于于7mL离心管中编号为离心管中编号为4#，离心，上清搜集，离心，上清搜集到另一个指管，编号为到另一个指管，编号为5#，其他的培育液用，其他的培育液用 50mL离心管于离心管于5000rpm，4，离心，离心10min，弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破弃上清，菌体用裂解缓冲液重悬后用超声波破碎细胞或保管于碎细胞

15、或保管于20备用见实验十二。备用见实验十二。 5. 于紫外灯下察看于紫外灯下察看1# -5#管搜集的菌体或上清管搜集的菌体或上清液，察看哪支管有荧光，记录察看到的景象。液，察看哪支管有荧光，记录察看到的景象。留意：把留意：把1#和和2#管置管置4保管。分别标保管。分别标Sample1和和Sample2。 1236pUC18pGFPuv挑取单菌落，接种于挑取单菌落，接种于5mLLBA培育基中。培育基中。37过夜培育。过夜培育。按按1:100接种接种对照对照IPTG+GlcIPTG12361234525 -28培育过夜培育过夜5000rpm离离心，收菌体心，收菌体取取5mL离心离心其他离心收其他离

16、心收菌体，提取菌体，提取蛋白蛋白本卷须知本卷须知本实验的目的是比较该重组本实验的目的是比较该重组DNA在在大肠杆菌中表达时受大肠杆菌中表达时受IPTG和葡萄和葡萄糖存在的影响。在转管培育及收菌糖存在的影响。在转管培育及收菌时要留意各管编号要相应对好，不时要留意各管编号要相应对好，不能混乱。能混乱。 1#、2#管不加管不加IPTG和葡萄和葡萄糖。糖。3#管除加管除加IPTG外还参与葡萄外还参与葡萄糖浓度要大于糖浓度要大于0.2%以上。以上。 6#瓶仅加瓶仅加IPTG 。不同的重组不同的重组DNA在不同的宿主菌中蛋白的在不同的宿主菌中蛋白的表达量往往遭到表达量往往遭到IPTG浓度和培育温度的影浓度

17、和培育温度的影响。在科研中普通都采用不同温度或不同响。在科研中普通都采用不同温度或不同浓度的浓度的IPTG来诱导，以获得最大的蛋白表来诱导，以获得最大的蛋白表达量。达量。本实验所表达的绿色荧光蛋白基因，其产本实验所表达的绿色荧光蛋白基因，其产物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后搜物在大肠杆菌中有很强的荧光。离心后搜集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色荧集的菌体在紫外线的照射下可见黄绿色荧光，所以把光，所以把1#、2#、3#、4#沉淀菌体放在沉淀菌体放在紫外灯下察看其能否有荧光以及荧光的强紫外灯下察看其能否有荧光以及荧光的强弱，就可判别其能否有表达及其所表达的弱，就可判别其能否有表达及其所表达的强度

18、。强度。实验安排实验安排 第一天：第一天： 上午配试剂，灭菌；上午配试剂，灭菌； 下午开场接种，约下午开场接种，约3 h-4h后开场诱导。步骤后开场诱导。步骤2、3 第二天：第二天： 收菌、紫外察看结果和拍照；收菌、紫外察看结果和拍照； 破碎细菌，分别上清，待过破碎细菌，分别上清，待过柱。柱。思索与讨论思索与讨论对紫外灯下察看到的结果作出解释。对紫外灯下察看到的结果作出解释。为什么诱导表达的大肠杆菌要在其为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD600浓度约为浓度约为0.5时参与时参与IPTG？大肠杆菌的诱导表达常受哪些要素大肠杆菌的诱导表达常受哪些要素的影响？的影响？实验目的实验目的实验原理实验原理

19、资料与试剂资料与试剂实验仪器实验仪器操作步骤操作步骤本卷须知本卷须知实验安排实验安排思索与讨论思索与讨论一实验目的一实验目的学习亲和层析的原理。学习亲和层析的原理。掌握亲和层析法分别蛋白质的技术与操掌握亲和层析法分别蛋白质的技术与操作。作。实验原理实验原理以普通凝胶作载体，衔接上金属离子制以普通凝胶作载体，衔接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分别纯化蛋白质，成螯合吸附剂，用于分别纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。这种方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的实际根据。知蛋白质中的组氨酸和法的实际根据。知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基

20、在接近中性的水溶液中能半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子构成比较稳定的络合物，与镍或铜离子构成比较稳定的络合物，因此，衔接上镍或铜离子的载体凝胶可因此，衔接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。蛋白质。过渡金属元素镍在较低过渡金属元素镍在较低pH范围时范围时pH 6-8，有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。在碱性和蛋白质。在碱性pH时吸附更有效，但选时吸附更有效，但选择性降低。择性降低。金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质

21、分子外表咪唑基和巯基的稠密肽和蛋白质分子外表咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基能够也很重要。程度所支配，吲哚基能够也很重要。用用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进展分别，且操作简单，快速，纯化析法进展分别，且操作简单，快速，纯化效率高。效率高。资料与试剂资料与试剂资料资料 含含pUC18质粒工程菌及含重组质粒工程菌及含重组pGFPuv质粒工程菌经诱导表达的细质粒工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白。胞裂解蛋白。试剂试剂0.05mol/L EDTA-0.5mol/L NaCl溶液溶液

22、50mL2mol/L NaCl 溶液溶液 50mL1mol/L NaOH溶液溶液 50mL0.2mol/L NiSO4溶液溶液 30mL起始缓冲液：起始缓冲液：50mmol/L Tris-HCl; 500mmol/L NaCl; pH7.0 500mLChelating Sepharose Fast Flow 4-5 mL大肠杆菌细胞裂解蛋白样品大肠杆菌细胞裂解蛋白样品 10-20mL洗涤液：洗涤液：50mmol/L咪唑；咪唑；50mmol/L Tris-HCl； 0.5mol/L NaCl，pH 7.0洗脱液：洗脱液：300mmol/L咪唑；咪唑；50mmol/L Tris-HCl；0.5m

23、ol/L NaCl，pH7.0 实验仪器实验仪器 1.5cm X 50cm层析柱、层析柱、自动分部搜集器、紫外分光光度自动分部搜集器、紫外分光光度计、紫外检测仪及记录仪等。计、紫外检测仪及记录仪等。操作步骤操作步骤样品的制备样品的制备: 细胞的培育及荧光蛋白表达见细胞的培育及荧光蛋白表达见实验十，细胞的破碎及蛋白的搜集如下：实验十，细胞的破碎及蛋白的搜集如下： 搜集在搜集在25培育的细胞培育液，培育的细胞培育液，5000r/min，离心，离心10min，去上清液，去上清液，菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心搜集菌菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心搜集菌体，用三分之一细胞培育液体积体，用三分之一细胞培育

24、液体积15mL的起始缓冲液充分悬浮，冰浴的起始缓冲液充分悬浮，冰浴下进展超声波处置，功率为下进展超声波处置，功率为400W，任务，任务4秒，间隙秒，间隙4 秒，为一次，秒，为一次，99次为一周期。次为一周期。共处置六周期。然后共处置六周期。然后8000r/min,离心离心30min，取上清液。放冰箱备用。，取上清液。放冰箱备用。 亲和层析柱的安装亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端把层析柱固定在铁支架上，柱下端出口封锁。参与少量的无离子水，排去下出口封锁。参与少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出端的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝乙醇浸泡的螯合凝胶胶4mL到烧杯中，参与少量的无

25、离子水制到烧杯中，参与少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，翻开下端的排水口，让亲凝胶倒进柱内，翻开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为和凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为4-5mL。亲和凝胶的再生处置：亲和凝胶的再生处置：用用10 倍柱体积的再生溶液倍柱体积的再生溶液0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCl过柱，流速过柱，流速3mL/min。1drops/2s!用用5倍柱体积的倍柱体积的2 mol/L NaCl 溶液洗亲和层析溶液洗亲和层析柱除去多余的柱除去多余的EDTA。流速。流速3mL/m

26、in。用用5倍柱体积的倍柱体积的1 mol/L NaOH溶液洗涤层析溶液洗涤层析柱，流速柱，流速2mL/min。用用10倍柱体积的无离子水洗至倍柱体积的无离子水洗至pH8-9，流速，流速3mL/min。用用2倍柱体积的倍柱体积的0.2mol/L的硫酸镍溶液过层析的硫酸镍溶液过层析柱，使凝胶金属镍离子结合柱，使凝胶金属镍离子结合, 流速流速2mL/min。过完后放置过完后放置5 分钟。分钟。用用10倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余的镍离子。流速余的镍离子。流速3mL/min。用用5 倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用。备

27、用。 上样：上样： 先从先从15mL裂解上清液中取出裂解上清液中取出50L预备用于预备用于电泳，作为亲和层析分别前上清液中的总蛋区电泳，作为亲和层析分别前上清液中的总蛋区带对照图谱带对照图谱Sample3。然后以每分钟。然后以每分钟1mL的的流速上层析柱，分部搜集流出液，每管流速上层析柱，分部搜集流出液，每管3mL，测得的测得的OD280值曲线为穿流峰，取最高的一值曲线为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳，标管样品液用作电泳，标Sample4。再用。再用10mL起始缓冲液过层析柱，操作同前。起始缓冲液过层析柱，操作同前。 洗涤：洗涤： 用含用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液咪唑的洗涤缓冲液

28、25mL洗脱，洗脱，分部搜集洗脱液，每管分部搜集洗脱液，每管5mL，取中间管样品电，取中间管样品电泳泳Sample5 。 洗脱：洗脱： 用含用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液咪唑的洗脱缓冲液10mL洗脱，洗脱，用用Ep管分部搜集洗脱液。每管收管分部搜集洗脱液。每管收0.5mL。测。测得的得的OD280值曲线峰为目的蛋白峰值曲线峰为目的蛋白峰GFP，标，标Sample6 。 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：进展进展12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分别纯化的结果。层析分别纯化的结果。Sample1-6，外加，外加Marke

29、r见实验十一。见实验十一。 本卷须知本卷须知不论是装柱还是上样、洗脱，在整个操不论是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。否那么，凝胶柱会产生气泡，柱平面。否那么，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。就会影响层析效果。样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分别效果才好。分别效果才好。亲和层析剂可回收，经再生可循环运用。亲和层析剂可回收，经再生可循环运用。该亲和层析剂用该亲和层析剂用20%乙醇浸泡于冰箱保乙醇浸泡于冰箱保管。管。亲和层析柱在再生处置、上样、洗脱过亲和层析柱在再生处置、上样、洗脱过程中其

30、颜色都有明显变化白、蓝、程中其颜色都有明显变化白、蓝、绿，只需细心操作，样品能否被吸附绿，只需细心操作，样品能否被吸附上去或被洗脱下来？都能察看到从而作上去或被洗脱下来？都能察看到从而作出判别。出判别。实验安排实验安排 先用母液配制其它未配制溶先用母液配制其它未配制溶液，再生镍柱；然后，过柱纯化液，再生镍柱；然后，过柱纯化重组蛋白。重组蛋白。 思索与讨论思索与讨论解释解释IPTG诱导表达的荧光蛋白经诱导表达的荧光蛋白经12 SDS-PAGE电泳结果图谱。电泳结果图谱。镍柱在再生处置、上样、洗脱过程镍柱在再生处置、上样、洗脱过程中其颜色有何变化？为什么？中其颜色有何变化？为什么？要到达好的分别效

31、果要留意哪些问要到达好的分别效果要留意哪些问题？题？实验目的实验目的实验原理实验原理资料与试剂资料与试剂实验仪器实验仪器操作步骤操作步骤本卷须知本卷须知实验安排实验安排思索与讨论思索与讨论一一.实验目的实验目的 了解了解SDS-PAGE灵敏度高，分辩率强的原灵敏度高，分辩率强的原理。理。用此法分析不同条件下培育的菌其荧光蛋用此法分析不同条件下培育的菌其荧光蛋白表达情况。白表达情况。 实验原理实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯 酰 胺 凝 胶 是 由 丙 烯 酰 胺 单 体烯 酰 胺

32、 凝 胶 是 由 丙 烯 酰 胺 单 体acrylamide,简称简称ACR和交联剂甲和交联剂甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺N,N-methylene bisacrylsmide 简称简称BIS在催化剂的作在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状构造的凝用下聚合交联而成的三维网状构造的凝胶，经过改动单体浓度与交联剂的比例胶，经过改动单体浓度与交联剂的比例可以得到不同孔径的凝胶。可以得到不同孔径的凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为速剂为N、N、N、N四甲基乙二胺简四甲基乙二胺简称称TE

33、MED。通常控制这两种溶液的用量。通常控制这两种溶液的用量使聚合在使聚合在1h内完成。内完成。2光聚合：通常用光聚合：通常用核黄素为催化剂，经过控制光照时间和强度核黄素为催化剂，经过控制光照时间和强度来控制聚合时间也可加速反响。本实验采用来控制聚合时间也可加速反响。本实验采用化学聚合。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：化学聚合。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为延续的凝胶仅有分别胶电泳；第一类为延续的凝胶仅有分别胶电泳；第二类为不延续的凝胶浓缩胶和分别胶第二类为不延续的凝胶浓缩胶和分别胶电泳。电泳。通常聚丙烯酰胺凝胶不延续电泳有三种通常聚丙烯酰胺凝胶不延续电泳有三种效应：电荷效应；电泳物所带电

34、荷的差效应：电荷效应；电泳物所带电荷的差别性。别性。 凝胶的分子筛效应。凝胶的网凝胶的分子筛效应。凝胶的网状构造及电泳物的大小外形不同所致浓状构造及电泳物的大小外形不同所致浓缩效应，凝胶浓度的不延续性、缓冲液离缩效应，凝胶浓度的不延续性、缓冲液离子成分的不延续性、电位梯度的不延续性以子成分的不延续性、电位梯度的不延续性以及及pH的不延续性所致。因此，样品分别效的不延续性所致。因此，样品分别效果好，分辨率高。果好，分辨率高。SDS-PAGE，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS十二烷基磺酸钠。十二烷基磺酸钠。SDS破坏蛋白质的破坏蛋白质的二级和三级构造；强复原剂使半胱

35、氨酸之间二级和三级构造；强复原剂使半胱氨酸之间的二硫键断裂，因此，蛋白质在一定浓度的的二硫键断裂，因此，蛋白质在一定浓度的含有强复原剂的含有强复原剂的SDS溶液中，与溶液中，与SDS分子按比分子按比例结合，构成带负电荷的例结合，构成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量的这种复合物由于结合大量的SDS，降低或消除，降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差别。而了各种蛋白质分子之间天然的电荷差别。而由于由于SDS与蛋白质的结合是按大小成比例的，与蛋白质的结合是按大小成比例的，在进展电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决在进展电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当

36、分子量在于分子大小。当分子量在15KD到到200KD之间之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：，式中：MW为分子量，为分子量，X为迁移率，为迁移率，k、b均为常数。均为常数。试剂试剂30%的凝胶贮备液的凝胶贮备液: Acr 29g + Bis 1g溶于溶于100mL去离子去离子水中。避光储存棕色瓶中。水中。避光储存棕色瓶中。3M Tris-HCl (pH8.9): 36.6g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至至100mL5Tris-甘氨酸电泳甘氨酸电泳buffer

37、pH8.3): Tris-base15.1g + 甘氨酸甘氨酸94g + 5gSDS + H2O至至1L用时稀释用时稀释5倍。倍。 10%SDS：10g SDS溶解于溶解于100mL去离子水去离子水中，储存于室温中。中，储存于室温中。0.5M Tris-HCl(pH6.8): 6.05g Tris-base + 48mL 1M HCl + dH2O至至100mLTEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺):浓度浓度10%，20 mL (共用共用)10% AP(过硫酸铵过硫酸铵):10 mL，1g AP溶解于溶解于10mL去离子水中，新颖配制。去离子水中，新颖配制。 2x样品缓冲液：样品缓冲液： 10

38、0mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT(二硫苏糖醇二硫苏糖醇) 4% SDS 0.2% 溴酚蓝溴酚蓝 20% 甘油甘油 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250溶溶于于45mL甲醇中，加甲醇中，加10mL冰醋酸冰醋酸 + H2O至至100mL。滤纸过滤除去不溶物。滤纸过滤除去不溶物 脱色液：脱色液：75mL冰乙酸冰乙酸 + 50mL甲醇甲醇 + 875mL H2O如只配如只配500mL，各物质减半，各物质减半实验仪器实验仪器 电泳仪、垂直板电泳安装、电泳仪、垂直板电泳安装、微量进样器微量进样器50L、染色、染色/脱色摇床等。脱色摇床等。操作

39、步骤操作步骤胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻胶板模型的安装：在干净的带隔板的玻璃板的三条边上把橡胶条压上，然后将璃板的三条边上把橡胶条压上，然后将另一块凹形玻璃板压上，放入电泳槽中。另一块凹形玻璃板压上，放入电泳槽中。示范示范12%分别胶的制备每次配分别胶的制备每次配10 mL 去离子水去离子水 3.2mL 30% 凝胶液凝胶液 4.0mL 3mol/L Tris-HCl(pH8.9) 2.6mL 10% SDS 0.1mL 10% APS 0.1mL TEMED 0.005mL 用手轻摇约用手轻摇约2 2分钟混匀分钟混匀( (留意不要产生气泡留意不要产生气泡, ,小心将混合液注入预备好的玻

40、璃板间隙中，为浓缩小心将混合液注入预备好的玻璃板间隙中，为浓缩胶留足够的空间，悄然在顶层参与几毫升去离子水胶留足够的空间，悄然在顶层参与几毫升去离子水复盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制造用。刚参与复盖，以阻止空气中氧对凝合的抑制造用。刚参与水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消逝，不水时可看出水与胶液之间有界面，后渐渐消逝，不久又出现界面，这阐明凝胶已聚合。再静置片刻使久又出现界面，这阐明凝胶已聚合。再静置片刻使聚合完全。聚合完全。 ！留意：为防止凝胶过快聚合，配胶用的无离子！留意：为防止凝胶过快聚合，配胶用的无离子水、水、30%30%的凝胶液及的凝胶液及Tris-HClTris-HCl缓冲液应

41、事先于缓冲液应事先于44或或冰上放置冰上放置, ,以下同。以下同。浓缩胶的制备：先吸去已聚合好的分别胶上浓缩胶的制备：先吸去已聚合好的分别胶上层的水，用水洗界面一次，再用滤纸吸干残层的水，用水洗界面一次，再用滤纸吸干残留的水液。按以下配方制备留的水液。按以下配方制备5毫升浓缩胶溶液。毫升浓缩胶溶液。混合后将其注入分别胶上端，插入梳子应小混合后将其注入分别胶上端，插入梳子应小心防止气泡。心防止气泡。 去离子水去离子水 3.2mL 30% 凝胶液凝胶液 0.83mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8) 0.75mL 10% SDS 0.050mL 10% AP 0.050mL TEMED 0

42、.005mL在浓缩胶聚合的同时，将样品与在浓缩胶聚合的同时，将样品与5 5样品缓冲液样品缓冲液16L16L 4L 4L混合，混合，100100加热加热3 3分钟以变性蛋白质。分钟以变性蛋白质。Sample1,2Sample1,2用用600L600L起始缓冲液悬浮，取起始缓冲液悬浮，取16L16L同上操作。同上操作。浓缩胶聚合完全后，小心地拔出梳子，用无离子水冲洗梳孔，将浓缩胶聚合完全后，小心地拔出梳子，用无离子水冲洗梳孔，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均参与凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均参与1X1X电泳缓冲液，电泳缓冲液，检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡，上样前用检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡，上样前用上槽缓冲液冲洗梳子孔。上槽缓冲液冲洗梳子孔。按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，20L/20L/孔，一孔加一个样品，同时安排知分子量的规范物作对照。孔，一孔加一个样品，同时安排知分子量的规范物作对照。电泳：开场时浓缩胶电压为电泳：开场时浓缩胶电压为80V，染料进入，染料进入分别胶后，将电压增到分别胶后，将电压增到120V，继续电泳至染，继续电泳至染料溴酚蓝到分别胶底部，断开电源。料溴酚蓝到分别胶底部，断开电源。8固定及染色：取下凝胶放入大培育皿，