第二十章__高效液相色谱(20110512)

1、 高压液相色谱法在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法，也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。 输液泵输液泵高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确

2、性。 . 对输液泵的基本要求流量准确可调。流动相的流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于0.5%。耐高压。高效液相色谱柱是将很细颗粒（3-10um粒径）的填料，在高压下填充到柱管中，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动。泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。泵的结构材料应耐化学腐蚀。 输液泵输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这

3、是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。 脱气装置脱气装置流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。目前，液相色谱流动相脱气使用较

4、多的是离线超声波目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。梯度洗脱装置梯度洗脱装置为什么要进行梯度洗脱？在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。 梯度洗脱操作线性梯度线性梯度： 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。阶梯梯度阶梯梯度： 直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种

5、组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。色谱填料： 经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10微米粒径

6、的球形颗粒。色谱柱管： 内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。色谱柱： 也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的, 填料的结构色谱填料是由基质和功能层两部分构成。基质： 又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。功能层： 是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。填料的物理结构： 分为微孔型（或凝胶型）、大孔型（全多孔型）、薄壳型和表面多孔型四种类型。 紫外紫外

7、-可见光检测器可见光检测器原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。二极管阵列检测器 以光电二极管阵列（作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通U

8、V-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。 直接紫外检测： 所使用的流动相为在检测波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接测定被测组分的紫外吸收强度。间接紫外检测： 使用具有紫外吸收的溶液作流动相，间接检测无紫外吸收的组分。柱后衍生化光度检测： 对于那些可以与显色剂反应生成有色配合物的组分，可以在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适的显色剂反应，在可见光区检测生成的有色配合物。示差折光检测器示差折光检测器原理：基于样品组分的折射率与流动

9、相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RI是一种通用的检测方法。虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。荧光检测器荧光检测器原理： 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。特点：

10、有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。电导检测器（电导检测器（conductivitydetector,CD）原理： 基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。 电导检测器是离子色谱中必备的检测器。电导池是其核心。电导池的结构： 检测体积可达到微升甚至纳升级。基本结构是在柱流出液中放置两根电极，然后通过适当的电子线路测量溶液的电导。蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加热漂移管、激光光源和光检测器等部件构成。因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，

11、而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。 三、三、影响分离的因素影响分离的因素 在高效液相色谱中, 速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，而只有两项，即： H = A + C u 故高效液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。1.影响分离的因素影响分离的因素流速流速 流速大于

12、0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。2.固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度； 研制高效柱填料是一活跃领域。液相色谱流动相液相色谱流动相3.流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性 （1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相

13、色谱中显得特别重要。色谱中显得特别重要。液相色谱的流动相又称为：淋液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。洗液，洗脱剂。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。分离柱上的出峰顺序相反。流动相组成流动相组成流动相按组成不同

14、可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 吸附色谱的分离机理 随着样品在固定相上的吸附能力由大到小 在色谱柱上的保留由长到短 吸附色谱

15、概述分离基于样品的极性差异。洗脱次序 一般为正相，即：极性低的先被洗脱常用的流动相 非极性有机溶剂，如己烷常用固定相 硅胶、氧化铝。二、二、LSC固定相固定相 流动相的选择流动相的选择 应用由于硅羟基活性点在硅胶表面常按一定几何规律排列，因此吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法。如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离 分配色谱的分离机理基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑

16、制方法常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相 键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响缺点 pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同 反相HPLC由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。 （1）适用于分离几乎所有类型的化合物）适用于分离几乎所有类型的

17、化合物（2）特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分）特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件离创造了条件（3）有很好的化学稳定性和热稳定性）有很好的化学稳定性和热稳定性（4）柱效高，使用周期长，分析重现性好）柱效高，使用周期长，分析重现性好 离子交换树脂的分离机理离子交换色谱概述适用于离子型化合物的分离分离基于离子的带电特性洗脱次序受多种因素的影响 填料（离子交换树脂）的种类 阴/阳，强/弱，交换基团 样品分子特性 盐的种类、浓度 温度及pH值 有机溶剂 离子对色谱无机离子以及离解很强的有机离子通常可以采用离子交换色谱或离子排斥色谱进行分离。有很多大分子或离解较弱的有机离子需要采用通常用于中

18、性有机化合物分离的反相（或正相）色谱。然而，直接采用正相或反相色谱又存在困难，因为大多数可离解的有机化合物在正相色谱的硅胶固定相上吸附太强，致使被测物质保留值太大、出现拖尾峰，有时甚至不能被洗脱。在反相色谱的非极性（或弱极性）固定相中的保留又太小。在这种情况下，就可采用离子对色谱。 离子对色谱在流动相中加入适当的具有与被测离子相反电荷的离子，即离子对试剂，使之与被测离子形成中性的离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱柱上被保留。保留的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的浓度。离子对色谱也可采用正相色谱的模式，即可以用硅胶柱，但不如反相色谱效果好，多数情况下采用反相色谱模式，所

19、以离子对色谱也常称反相离子对色谱。 固定相： 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。流动相：在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。凝胶过滤色谱： 以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱：以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。 液相色谱的方法开发第一步干什么?想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘)对色谱柱有足够的了解

20、掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精密度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离时要了解哪方面的情况？要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?一般的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节柱长度改变柱效及分离速度请记住请记住 每次改变一个参数 每次改变一个参数使用文献方法色谱柱填料的种类、品

21、牌是否相同?注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量反相色谱的方法开发开发过程实例 色谱条件 色谱柱：C18，4mm30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：1ml/min 样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)改变容量因子 K60/4050/5040/60谱图改变选择性a通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂改变色谱柱62:38/42:

22、58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF离子型化合物的分离方式使用离子交换柱 离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子使用反相柱 离子抑制色谱法 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法 加入“对离子”，使样品呈中性离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内常用缓冲液及其pH值离子抑制色谱实例在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234离子抑制色谱的使用范围如果：一些酸在pH低于2时还保持离子化一些碱在pH高于7时还保持离子化可以有以下的选择 离子交换色谱 使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法”离子对色谱法在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子”