级硕士实验课补体依赖细胞毒试验

1、闫东梅闫东梅实实 验验 原原 理理l细胞性抗原细胞性抗原与与特异性抗体特异性抗体(igg1,2,3(igg1,2,3或或igm)igm)的结合可的结合可激活激活补体补体活化的经典途径，引起细胞膜损伤，膜通活化的经典途径，引起细胞膜损伤，膜通透性改变而吸收染料，使细胞着色，胀大而死亡，透性改变而吸收染料，使细胞着色，胀大而死亡，失去正常的折光性。根据死细胞的多少判断细胞毒失去正常的折光性。根据死细胞的多少判断细胞毒性的强弱。性的强弱。l本次实验采用抗本次实验采用抗thy-1thy-1血清血清( (thy-1thy-1是是t t细胞的一种表细胞的一种表面标志面标志) )与小鼠的胸腺和脾的与小鼠的胸

2、腺和脾的t t细胞细胞相互作用，通过相互作用，通过激活激活补体补体对胸腺和脾的对胸腺和脾的t t细胞进行杀伤。细胞进行杀伤。t cell细胞溶解现象细胞溶解现象补体补体t t细胞细胞+ +抗抗thy-1thy-1抗体抗体+mac实实 验验 原原 理理 示示 意意 图图实验分组实验分组l四人一组，四人一组，1 1只小鼠只小鼠/ /组。组。l两人做脾，两人做胸腺。两人做脾，两人做胸腺。物品分配物品分配器材名称器材名称量量/ /组组试剂名称试剂名称量量/ /组组操作步骤操作步骤1.1.将将3ml3ml pbspbs加入平皿中。加入平皿中。2.2.小鼠脱颈处死，取脾和胸腺小鼠脱颈处死，取脾和胸腺( (

3、分别位于左侧腹部和胸骨柄处分别位于左侧腹部和胸骨柄处) )3.3.取胸腺和脾脏分别放到平皿中，用直头镊子固定组织，用弯取胸腺和脾脏分别放到平皿中，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎，再将头镊子轻压组织，将其捣碎，再将3-43-4层纱布覆盖到组织上，层纱布覆盖到组织上，然后用滴管隔着纱布将细胞悬液吸出。然后用滴管隔着纱布将细胞悬液吸出。4.4.按下图加样：按下图加样：5.5.混匀后放置混匀后放置3737水浴，孵育水浴，孵育4040分钟。分钟。6.6.取出后每管加入取出后每管加入50ul50ul台酚兰染液，混匀后立即取出染色的台酚兰染液，混匀后立即取出染色的细胞悬液细胞悬液20ul2

4、0ul滴到玻片上，用盖玻片盖上，在显微镜下观滴到玻片上，用盖玻片盖上，在显微镜下观察。察。7.7.观察结果：计数观察结果：计数200200个细胞中死细胞数个细胞中死细胞数( (死细胞形态为肿胀死细胞形态为肿胀变大，失去折光性，呈变大，失去折光性，呈兰色兰色) )。8.8.结果判定结果判定 ：加加 样样 方方 法法试管试管阳性管阳性管( (m ml)l) 阴性管阴性管( (m ml)l)100100100100100100100100100100100100阳性管阳性管阳性管阳性管阴性管阴性管ag+ab+cag+ab+cag+cag+c细胞毒百分率细胞毒百分率(%)=(%)=阳性管活细胞数阳性管活细胞数阴性管活细胞数阴性管活细胞数)100%100%(1-注意事项注意事项l靶细胞浓度要适中，过高或过低均会影响试验结果靶细胞浓度要适中，过高或过低均会影响试验结果。l台酚兰染色时间不要太长，因为台酚兰本身具有一台酚兰染色时间不要太长，因为台酚兰本身具有一定的毒性作用，可致细胞死亡定的毒性作用，可致细胞死亡。l补体要新鲜采集，三只以上的豚鼠的血清混合。补体要新鲜采集，三只以上的豚鼠的血清混合。补体依赖性细胞毒实验的应用补体依赖性细