小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能研究

1、小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的别离及分化潜能研究华南师范大学学报(自然科学版)2021 年 2 月 JOURNAL OF SOUTH CHINA NORMAL UNIVERS1TY14 卷第 1 期(NATURAL SCIENCE EDITION) Feb. 2021 Vol. 44 No. 1文章编号：1000-5463(2021)01-0103-06小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的别离及分化潜能研究曾晓辉,张玉影,邓禄刚,李雪峰*(华南师范大学生命科学学院,广东广州510631)摘要：从小鼠孤雌生殖的胚胎中可别离出孤此雌生殖胚胎干细胞(pES) , 3 传代培养25代,能表达很强的碱性磷酸酶,核型稳定呈

2、40XX;培养至第18代在体内可诱导肿瘤形 成,并分化为3个胚层的组织细胞.免疫组化结果显示神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、肌肉特异性肌动蛋白 A -actin 均呈阳性,传至第2024代的pES细胞,经体外定向诱导 分化为节律性收缩的心肌细胞及神经细胞.免疫组化检测显示节律性收缩的心肌细胞表达 A -actin,而神经细胞表达NSE.结果说明：利用免疫外科法可从孤雌生殖的小鼠胚胎建立pES,这些pES在体内、体外都具有分化为多种类型细胞的潜能.关键词：小鼠；孤雌生殖；胚胎干细胞；分化潜能中图分类号：Q132. 4; Q132. 8; Q813文献标志码:A胚胎干细胞(ES)具有无限增殖的水

3、平,并可在体外被诱导分化为特定的细胞,在人 类疾病的细胞或组织替代治疗中发挥着极其重要的作用,ES细胞也是基因打靶的重要条件之一,成为近年来生命科学领域研究的焦点.最早别离ES细胞的方法是从囊胚内细胞团中进行别离1-2胎干细胞(pES),建立并完善小鼠pES别离与克隆的技术体系；并对别离的pES的 分化潜能进行了体内、体外初步研究,对体内和体外分化的细胞进行免疫组织化学和免疫 细胞化学鉴定,以期探明小鼠pES细胞是否具有与正常受精 ES细胞同样的发育潜能.,但这种别离ES的方法势必破坏本身具有发育为完整个体的受精卵为代价,这在人类ES细胞的别离与培养上将会涉及诸多的伦理问题.为防止由损伤正常胚

4、胎发育所致的伦理问题,利用细胞融合的方法将体细胞与已建系的干细胞融合,诱导体细胞具有干细胞的特性或者将早期胚胎 的单个卵裂球培养为 ES细胞胞5341 材料和方法1. 1 材料SPF 级昆明KM小鼠、豚鼠及清洁级新西兰白兔均购自广州中医药大学动物实验中 心.Knockout DMEM 、Knockout血清替代品KSR、B -琉基乙醇B -ME 、胰蛋白酶 液0125%Trypsin +0.02%EDTA 等为 Gibco 公司产品；视黄酸RA, CAS#:302-79-4 和重 组小鼠白血病抑制因子mLIF由MbChemfe产.碱性磷酸酶alkaline phosphatase, AKP生化

5、检测试剂盒为上海科华东菱公司产品免疫组化分析用抗体兔抗鼠肌肉特异性肌动蛋白A -actin、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶NSE及二抗异硫氟酸荧光素FITC标记的羊抗兔IgG,均由武汉博士德生物工 程生产；NycoPrepTM或者通过基因转移诱导体细胞转变为多能干细, 但这些方法获得干细胞的效率相对较低,远远低于从囊胚内细胞团别离 ES的效率. 卵母细胞经孤雌激活后得到的孤雌生殖胚胎,其早期发育特征与正常受精卵相同,但哺乳 动物孤雌生殖胚胎无发育为个体的潜力.因此,从孤雌生殖胚胎别离干细胞,假设其具有正 常干细胞的发育潜能,将减少因利用人类早期胚胎建立 ES所产生的道德和伦理上的争议, 是别离ES

6、细胞的另一种举措,对人类治疗性克隆开辟一条新途径6本研究通过免疫外科法别离孤雌生殖胚胎的胚收稿日期:2021-05-021.077A 小鼠基金工程：国家自然科学基金工程(30370724);广东省自然科学基金工程(*16)*通讯彳者,lixfscnu. edu. cn104华南师范大学学报(自然科学版)第44卷淋巴细胞别离液产自天津激洋生物制品科技有限责任公司实验用其他试剂均为Sigma公司分析纯产品.1.2实验方法6.2. 1兔抗鼠抗血清与补体制备 采用常规免疫方法,用小鼠脾脏别离的淋巴细胞作为抗原,连续静脉免疫兔4周,耳静脉采血进行抗血清效价测定.当血清效价到达1/8 以上时,心脏采血制备

7、兔抗鼠抗血清,56e水浴灭活30min,过滤除菌,分装,-20e 保存 备用.本实验用豚鼠血清作为补体.经心脏采血制备豚鼠血清,过滤除菌,分装,-20e 保 存备用.1.2. 2卵母细胞的孤雌激活与培养参照张玉影等71mL 碱性磷酸酶显色缓冲液中,参加对甲苯胺兰、氯化硝基四氮嚏蓝各 50L L,充分 混合后参加到pES细胞样集落的皿中,室温中避光孵育约20min,显色,自来水冲洗以终 止反响.1.2. 4 pES的细胞核型分析 取传代到第1015代的pES细胞,传代培养3d后,用含0. 08mg /L秋水仙素的培养液处理 2h;吸出含秋水仙素的溶液,参加0. 25%Trypsin +0102%

8、EDTA消化成单细胞悬液,再用0. 075mol/L 氯化钾低渗处理15min, 用甲醇-冰醋酸固定后,滴片,改进品红染色,油镜观察,对细胞进行核型分析.1.2. 5 pES细胞的体外分化实验(1) 类胚体(embryonic bodies, EB) 形成实验 取指数生长期的pES细胞集落,用 0105%Trypsin +0102%EDTA消化成小的细胞团块,离心去掉消化液,用不添加mLIF的 pES细胞培养液按11吓/L密度重悬细胞.将25L L上述细胞悬液接种于培养皿的皿盖 内部上,参加5mL PBS液,放入培养箱中培养,每天半量更换培养液；待EB形成后转入 四孔板中,参加不含mLIF的干

9、细胞培养液继续培养,为体外分化做好准备.(2) pES细胞体外分化为心肌细胞将EB接种到铺有明胶的培养皿内培养,用添加110-8的方法进行小鼠卵细胞的孤雌激活与培养.(1) 内细胞团的别离将发育到囊胚或扩张囊胚期的孤雌生殖小鼠胚1.2. 3 小鼠pES细胞的建系胎分别放入平衡好的酸性泰酪式液中,待囊胚透明带变薄后立即转移到PBS中清洗；然后将无透明带的小鼠孤雌生殖胚胎移入稀释到1/16的兔抗鼠血清中,培养箱培养20min,PBS洗去抗血清；移入稀释到1/16的豚鼠血清中作用1055min;用PBS洗胚胎2次,每 次2min;转入新的PBS中,用前端直径为2030L m的吸管轻轻吹打,去除滋养外

10、胚层即 可得到内胞团.(2) 孤雌生殖胚胎干细胞(pES)的克隆与培养传代将别离的内细胞团立即接入丝裂霉素C处理好的饲养层细胞上,37e 、5%CO 2饱和湿度下培养,每天更换添加1000U /mLmLIF的ES根底培养液(80%Knockout DMEM +20%KSR +0.1mmol/LB -ME +4mmol/LL -Glutamin +100L g /mL 青霉素 +100L g /mL 链霉 素+1%IE必需氨基酸).内细胞团接种后24h出现贴壁,2d可见具有典型的核大的小细胞 长出,34d后用细玻璃管取出,用0. 05%Trypsin +0. 02%EDTA 组成的消化液消化 2

11、min, 转入ES细胞培养液中,细吸管吹打,将打散的小细胞团块接种到新的处理好的饲养层细 胞上,每天更换培养液,23d后可见典型的ES细胞集落,34d后可继续传代.(3) pES集落的碱性磷酸酶鉴定取第1、2、15代的pES细胞集落,用4侬聚甲,mol/LRA +0.75%DMSO的ES根底培 养液组成的肌肉细胞定向诱导分化液培养EB,每天更换诱导培养液；待诱导分化10d出现有节律性跳动的细胞团块时,进行常规免疫组织化学染色,一抗为兔抗鼠肌肉特异性肌 动蛋白A -actin (1B 100),二抗为异硫氟酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG (1B100).阴性对照组以0. 01mol/LP

12、BS 代替一抗.(3) pES细胞体外分化为神经细胞将EB接种到铺有明胶的培养皿内培养,用添加510-7mol/LRA 的ES根底培养液组成的神经细胞定向诱导分化液培养EB,每天更换诱导培养液；培养68d后,EB松散出许多单个的细胞,1012d,这些散开的单细胞就贴壁生长 进行常规免疫细胞化学染色,一抗为兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶 (NSE) (1B 100), 二 抗为异硫氟酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG (1B 100). 阴性对照组以0. 01mol/LPBS 代替一抗.1.2. 6 pES细胞的体内分化实验 将传至18代的小鼠pES细胞消化后,接种至小鼠睾丸的被膜下,4.第1期

13、曾晓辉等：小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的别离及分化潜能研究105膜下形成肿瘤,将肿瘤进行常规石蜡切片,HE染色,显微镜观察2 结果2. 1 小鼠pES细胞的AKP染色及核型分析小鼠胚胎孤雌激活发育到扩张囊胚时期,去掉透明带后图1A,在抗血清中孵育 20min后,移入补体孵育约20min,滋养外胚层细胞肿胀图1B,轻轻吹打,别离得到 内细胞团图1C.经培养34d后可见生长出原代 pES细胞图1D.原代pES经碱性 磷酸酶检测呈阳性图1E,经胰酶消化和屡次传代培养可形成形态正常的pES细胞克隆图 1FA:第2代pES AKP呈强阳性；B:第15代pES AKP呈强阳性；C, D:pES 的染色体与 核型

14、分析；标尺=200L m图2 pES细胞的AKP染色及核型鉴定Figure 2 The activity of alkaline phosphate enzyme of pES andkaryotype assessment2. 2 小鼠pES细胞的体外分化分别用肌肉细胞定向诱导分化液、神经细胞定向诱导分化液诱导培养EB,大约诱导10d后,出现有节律性的收缩心肌细胞图3A和神经细胞图3C.用肌肉组织和神经 组织特异性抗体进行免疫细胞化学分析,结果显示心肌细胞表达肌肉特异性肌动蛋白A -actin图3B,而神经细胞表达神经元特异性烯醇化酶NSE 图3D;说明小鼠pES细胞在体外具有分化为中胚层和

15、外胚层的潜能,与正常受精胚胎建系的 ES细胞系有相同的体外分化水平A:孤雌生殖囊胚；B:抗体、补体作用后滋养外胚层细胞肿胀；C:别离得到的内细胞团D:原代pES; E:原代pES的碱性磷酸活性检测；F:第25代时pES细胞；标尺=100L m图1内细胞团的别离及pES的培养Figure 1 Isolation of inner cell mass and culture of mouse pES选取第2代和第15代的pES,用AKP生化检测试剂盒染色 ES细胞集落,都能表达很 强的碱性磷酸酶图2A和2B,说明原代pES细胞在传代的过程中仍保持干细胞特性.对传代1015代的小鼠pES细胞进行核型

16、分析,结果显示pES细胞染色体为40条(图2C, 2D)A:相差显微镜下的心肌细胞；B:心肌细胞呈A -actin 阳性；C:相差显微镜下的神经 细胞；D:神经细胞呈NSE阳性；标尺=100L m图3小鼠孤雌生殖胚胎干细胞体外分化的免疫荧光检测Figure 3Immunocytochemistry of the differentiated mouse pESin vitro106华南师范大学学报(自然科学版)第44卷2. 3 小鼠pES细胞的体内分化将传至18代的小鼠pES细胞移植到小鼠睾丸被膜下,5周后,移植的8只中,有2 只小鼠睾丸异常增大,睾丸被膜下形成肿瘤,显微观察可见肿瘤组织中含有

17、3个胚层来源的组织细胞(图4):有源于外胚层的鳞状上皮和中枢神经组织等；源于中胚层的软骨细胞和肌肉组织等；源于内胚层的柱状上皮和肠管样组织等.说明小鼠pES细胞在体内具有分化为3个胚层组织的潜能,与正常受精胚胎建系的ES细胞系有相似的分化水平育的机制,鉴定、获得其关键基因；建立ES细胞向心肌细胞定向诱导分化的适宜培 养系统,是目前该研究领域亟待解决的问题 .尽管对ES细胞定向分化为心肌细胞的分子机制还不清楚,但DMSO®常用的诱导分化剂,能诱导ES细胞分化为心肌细胞、骨骼肌细胞,其作用机制主要是抑制 c -myc基 因表达,降低细胞内源性聚腺甘二磷酸核昔水平 .止匕外,有人发现维生素

18、 C可显著提升 ES细胞向心肌细胞分化的效率,使ES细胞可发生自动节律性收缩,肌小节肌球蛋白和 A9-辅肌动蛋白染色呈阳性.目前认为心肌发生相关因子,如转化生长因子B (TGF - B )、骨形态发生蛋白(BMP)、Wnt家族蛋白和成纤维细胞生长因子 (FGF)等,可促进ES 细胞分化为心肌细胞,增加心10肌细胞的分化效率.近年来,血清对于ES细胞分化的影响越来越受到重视,无血清 培养基可能更有利于 ES细胞向心肌细胞分化.PASSIER等采用无血清培养基诱导 ES细胞,发现其向心肌细胞分化的效率明显提升,心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍,如果在培养体系中参加维生素 C,分化效率还可

19、以提升 40%,同时心肌特异性的蛋白标志物表达也增加.在无血清培养基 DMEMfr添加KSR和BMP4,可以促进小鼠ES细胞向 跳动样心肌细胞分化的比率1211本研究将别离培养的pES细胞经体外悬浮培-8养先形成EB,在含有110mol/LRA和0. 75%DMSO的定向诱导培养液来诱导培养EB;EB经诱A:鳞状上皮；B:中枢神经组织；C:软骨细胞；D:肌肉组织；E:柱状上皮；F:肠管样组 织；标尺=200L m导分化大约10d后,分化为可自发节律性收缩的细胞团；免疫组化检测发现节律性收 缩的细胞团表达肌肉细胞特异性表达的肌动蛋白A -actin, 说明pES被成功定向诱导为心肌细胞.结果说明

20、RA和DMSCm合作用可有效地诱导 ES细胞定向分化为心肌细胞.3. 1.2 pES细胞向神经细胞的分化视黄酸(RA)在中枢神经、皮肤及骨骼系统的发育过程中具有重要作用.许多实当证实,RA是诱导ES细胞定向分化为神经细胞常用的诱 导剂.RA属脂溶性留体类激素家族,扩散进入细胞后与其胞内受体CRABP (cellularretinoic acid binding protein)结合,形成复合物转入细胞核调控一系列基因的表达,最终使细胞表型发生转变引起细胞分化.WILES等13图4小鼠孤雌生殖胚胎干细胞体内分化结果Figure 4 Differentitation of mousepES in

21、vivo3 讨论3. 1 pES细胞的体外定向诱导分化ES细胞体外分化分为一般分化和定向分化2类.一般分化是指不参加任何诱导剂,让其自然分化为不同类型的细胞,但由于分化的细胞较杂,应用意义不大.定向分化指针 对不同的靶细胞,选择不同的分化方法和分化诱导剂,使其发生特异性分化7-8是目前ES分化研究的主要目标,也是ES细胞进行细胞替代治疗的根底.3. 1. 1 pES细胞向心肌细胞的分化研究ES细胞发现,RA 可通过激活抑胰蛋白(follistatin)来抑制骨形成蛋白,从而使小鼠ES细胞向神经细胞方向分化.第1期曾晓辉等：小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的别离及分化潜能研究107细胞分化,还可以抑制LI

22、F信号促进ES细胞分化.STRUBING等14S, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocystsJ.Science, 1998, 282(5391) :1145-1147.3 COWAN C A, ATIENZA J, MELTON D A, et al. Nu 2clear reprogramming of somatic cells after fusion with hu 2man embryonicstem cells J . Science , 2021, 309(5739) :1369-1373.4

23、CHUNG Y, KLIMANSKAYA I, BECKER S, et al. Em 2bryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres J . (7073) :216-219.5 TAKAHASHI K, YAMANAKA S. Induction of pluripo 2tent stem cells from adult human fibroblasts by defined factorsJ. Cell, 2021, 126(4) :663-676.6 BREVINI T

24、 A, GANODOLFI F. Parthenotes as a sourceof embryonic stem cells J. Cell Proliferat, 2021, 41(S1) :20-30.7 张玉影,曾晓辉,付晓兰,等.不同化学激活方法对小鼠卵母细胞孤雌激活效果的影响J.华南师范大学学报：自然科学版,2021(1) :98- 104.8 LUMELSKY N, BLONDEL O, LAENG P, et al. Diffe 2rentiation of embryonic stem cells to insulin -secreting structures simila

25、r to pancreatic islersJ. Science, 2001,292(5520) :1389-1394.9 TAKAHASHI T, LORD B, SCHULZE P C, et al. Asco 2rbic acid enchances differentiation of embryonic stem cells to cardiac myocytes J. Circulation, 2021, 107(14) :1912-1916.10 SINGLA D K, SOBEL B E. Enhancement by growthfactors of cardiac myoc

26、yte differentiation from embryonic stem cells:a promising foundation for cardiac regenera 2tionJ. Biochem Biophys Res Commun, 2021, 335:637-642.11 PASSIER R, OOSTWAARD D W, SNAPPER J, et al.Increased cardiomyocyte differentiation from human em 2bryonic stem cells in serum -free cultures J. Stem Cell

27、s, 2021, 23(6) :772-780.12 HONDA M, KURISAKI A, OHNUMA K, et al. N -cadherin is a useful marker for the progenitor of cardio 2myocytes differentiated from mouse ES cells in serum -free conditionJ. Biochem Bioph Res Co, 2021, 351:877-882.13 WILES M V, JOHANSSON B M. Embryonic stem celldevelopment in

28、a chemically defined mediumJ. Exp Cell Res, 1999, 247(1) :241-248.14 STRUBING C, AHNERT -HILGER G, SHAN J, et al.Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into in gives Nature,2021,439发现,在无LIF的培养条件下,ES细胞自发分化为神经细胞的比例仅为15%30%,而用RA诱导后EB中几乎全部细胞分化成神经细月包.SCHULDINER等15也证实,用高浓度RA(10mol /L) 诱导人ES细胞

29、产生的神经细胞比未用RA处理的增加22%.本研究用不含mLIF的胚胎干细胞培养液,添加510-7mol /LRA, 来诱导pES细胞得到了神经样细胞,免疫组化结果显示诱导出的神经细胞表达神经细胞特异性烯醇化酶NSE.结果也证实RA可诱导ES细胞定向分化为神经细胞.3. 2 pES细胞的体内分化检测ES细胞体内分化潜力的一种重要方法是将ES细胞注射入同源动物皮下、睾丸被膜等部位,可诱导形成畸胎瘤,畸胎瘤中含有来源于3个胚层的细胞.KIM等16人将小鼠pES细胞接种到裸鼠皮下可形成了畸胎瘤,畸胎瘤中含有3个胚层来源的细胞；并将小鼠pES细胞注射到小 鼠315d囊胚中,pES细胞可以参与胚胎发育并产

30、生有毛色嵌合的小鼠.标明小鼠pES具有多种分化潜能.本研究将别离的pES注射入同种动物睾丸被膜下,发现pES可诱导肿瘤的形成,组 织切片说明,所获得的肿瘤组织中存在多种类型的组织细胞,如：有源于外胚层的鳞状上皮和中枢神经组织；源于中胚层的软骨细胞和肌肉组织；源于内胚层的柱状上皮和肠管样 组织等.结果证实所别离获得的小鼠pES细胞具有分化发育成源于3个胚层的组织细胞类型的水平,具有与正常受精胚胎中别离的ES细胞完全相同的分化潜能.4 结论利用免疫外科法从孤雌生殖的小鼠胚胎可别离出孤雌生殖胚胎干细胞(pES),这些pES在体内、体外都具有分化为多种类型细胞的潜能 .该方法可为从人孤雌生殖胚胎中分

31、离干细胞提供一种技术参考.参考文献：I EVANS M J, KAUFMAN M H. Establishment in cultureof pluripotential cells from mouse embryosJ. Nature, 1981,292:154- 156.2J S108华南师范大学学报(自然科学版)tory and excitatory neuronsJ. Mech Dev, 1995, 53(2) :275-287.第44卷J . Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(21) :11307-11312.16 KIM K, LEROU P, Y

32、ABUUCHI A, et al. Histocompa 2tible embryonic stem cells by parthenogenesisJ. Sci 2ence, 2021, 315(5811) :481-486.15 SCHULDINER M, YANUKA O, ITSKOVITZ -ELDORJ, et al. Effects of eight growth factors on the differenti 2ation of cells derived from human embryonic stem cellsIsolation and Differentiatio

33、n Potential of Mouse Parthenogenetic Embryonic Stem CellsZENG Xiaohui, ZHANG Yuying, DENG Lugang, LI Xuefeng *(School of Life Science, South China Normal Univers ity, Guangz hou 510631, China)Abstract:Mouse pES isolated from mouse parthenogenetic blastocysts have the ability to proliferate at least

34、25gen 2erations in vitro and show very strong activity of alkaline phosphate enzyme. The karyotype of pES was showed as 40XX. To investigate the diffenentiation potential of mouse pES in vivo, pES at the 18generation were trypsinized and transferred into the testicle envelope of Kunming mouse, histo

35、morphological analysis showed that pES main 2tained the developmental potential to differentiate into advanced derivatives of all three primary germ layers -ecto 2derm, endoderm and mesoderm -in vivo. Immuno histochemical results showed that mouse testis had Neuron spe 2cific enolase (NSE) and muscl

36、e specific A -actin positive cells which derived from pES. Mouse pES at 20to 24passages were directionally induced to differentiate in vitro. The results showed that they can be induced into nerve cells and myocardial cells with the rhythm of contraction. Immunocytochemistry showed that myocardial c

37、ells were A -actin positive and nerve cells were NSE positive.Key words:mouse; parthenogenetic; ES; differentiation potential【责任编辑成文】Construction of Suppression Subtractive Hybridization Library from the Floral Buds of Paphiopedilum MicranthumWANG Yanjun 1, WEN Zhenzhen 2, ZHANG E 2, TAN Zhiyong 1, WANG Yaping 1, LIU Yunquan 2, LIU Wei 2(1. Institute of Agricultural Seeds, Dongguan 523063, China;2. School of Life Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)Abstract:With high ornamental and research value, Paphiopedilum