酶联免疫吸附测定法ppt课件

1、酶联免疫吸附测定法 生物体系中的化学丈量生物体系中的化学丈量裴丹青裴丹青0308115203081152 复杂生物体系中生命物质的化学丈量是提复杂生物体系中生命物质的化学丈量是提示生命奥妙的重要手段，在食品检验、疾病诊示生命奥妙的重要手段，在食品检验、疾病诊断和预防的过程中也日益凸现其重要作用。断和预防的过程中也日益凸现其重要作用。 经典的化学分析方法滴定分析、分量分经典的化学分析方法滴定分析、分量分析、简单的吸光光度法是以简单离子或分子析、简单的吸光光度法是以简单离子或分子为检测对象的常量或微量分析，面对生物体系为检测对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂且待测物浓度较低的测试条件那么往

2、成分复杂且待测物浓度较低的测试条件那么往往无能为力。往无能为力。 于是，一系列针对生物体系中化学成分的于是，一系列针对生物体系中化学成分的丈量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成丈量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它将免疫学知识与化学分析手段有机结合，员，它将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体系中高特异性、超微量的分析提供理为生命体系中高特异性、超微量的分析提供理处理方法。处理方法。 什么是什么是 酶联免疫分析技术酶联免疫分析技术 ELISA ELISA的根本原理和方法的根本原理和方法 ELISA ELISA的种类和变化的种类和变化 ELISA ELISA的特点的特点 ELIS

3、A ELISA的运用实例的运用实例 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术开展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA如今已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的根底上开展起来的一种新型的免疫测定技术 。 一、根本原理一、根本原理 它采用抗原与抗体的特异反响将待它采用抗原与抗体的特异反响将待测物

4、与酶衔接，然后经过酶与底物产生测物与酶衔接，然后经过酶与底物产生颜色反响，用于定量测定。测定的对象颜色反响，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体免疫吸附剂固相的抗原或抗体免疫吸附剂酶标志的抗原或抗体标志物酶标志的抗原或抗体标志物酶作用的底物显色剂酶作用的底物显色剂 丈量时，抗原抗体先结合在固相载体上，丈量时，抗原抗体先结合在固相载体上，但仍保管其免疫活性，然后加一种抗体抗原但仍保管其免疫活性，然后加一种抗体抗原与酶结合成的偶联物标志物，此偶联物仍保与酶结合成的偶联物标志物，

5、此偶联物仍保管其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体管其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原抗体反响结合后，上的抗原抗体反响结合后，再加上酶再加上酶的相应底的相应底物，即起物，即起催化水解催化水解或氧化复或氧化复原反响而原反响而呈颜色。呈颜色。 其所生成的颜色深浅其所生成的颜色深浅与欲测的抗原抗体含与欲测的抗原抗体含量成正比。量成正比。 这种有色产物可用肉这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显眼、光学显微镜、电子显微镜察看，也可以用分光微镜察看，也可以用分光光度计酶标仪加以测光度计酶标仪加以测定。定。 其方法简单，方便讯其方法简单，方便讯速，特异性强。速，特异性强。二、酶及其底物

6、二、酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原酶结合物是酶与抗体或抗原, , 半抗原半抗原在交联剂作用下结合的产物。是在交联剂作用下结合的产物。是ELISAELISA成败成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反响，还具有酶促反响，显示出生物免疫反响，还具有酶促反响，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反响将得到不同的颜色反响. .酶酶 底底 物物显色显色反应反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-

7、2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基

8、伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420420 ELISAELISA的种类和变化的种类和变化 一双抗体夹心法一双抗体夹心法二间接法二间接法三竞争法三竞争法 四双位点一步法四双位点一步法五捕获法测五捕获法测IgMIgM抗体抗体六运用亲和素和生物素的六运用亲和素和生物素的ELISA ELISA 一双抗体夹心法一双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相

9、载体衔接构成固相抗体载体衔接构成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 参与封锁蛋白溶液以封锁载体参与封锁蛋白溶液以封锁载体外表残留的蛋白结合位点外表残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封锁蛋白洗涤并除去未结合的封锁蛋白加受检标本抗原构成加受检标本抗原构成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标志抗体酶标志抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进展加底物进展酶催化反响酶催化反响 根据颜色反响的根据颜色反响的程度进展该抗原程度进

10、展该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标志的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。二间接法二间接法包被固相载体包被固相载体: : 用知抗原包被用知抗原包被固相载体固相载体 加待检标本加待检标本: : 使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体加酶标抗抗体: :与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体 加底物加底物显色显色 根据颜色反响的程度进展根据颜色反响的程度进展该抗原的定性或定量测定该抗原的定

11、性或定量测定三竞争法三竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体于测定抗体 。用知特异性用知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体 测定管加待测抗原和测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合 对看管只加一定量酶标抗原对看管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合 分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分 加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的吸光度值，根据对看管与测定管吸光度值之比，根据对看管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量计

12、算标本中待测抗原含量 对看管由于只加酶标抗原，与对看管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度那么随待测抗深；测定管的显色程度那么随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，固相上结合的酶标抗原量减少。因此，参与底物后显色反响较弱。参与底物后显色反响较弱。 特点一：灵敏性特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告集团的该测定法的灵敏度来自作为

13、报告集团的酶。众所周知酶。众所周知, , 酶是一种有机催化剂，很少酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反响量的酶即可诱导大量的催化反响 ，产生可，产生可供察看的显色反响景象。因此该体系常被称供察看的显色反响景象。因此该体系常被称为酶放大体系。为酶放大体系。ELISAELISA实现了在细胞或亚细实现了在细胞或亚细胞程度上示踪抗原或抗体的所在部位，或在胞程度上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克程度上对其进展定量。微克、甚至纳克程度上对其进展定量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时，例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/m

14、l程度，酶反响程度，酶反响测定法的敏感度约为测定法的敏感度约为510g/ml 510g/ml 。 特点二：特异性特点二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合本质上只发生在抗原的抗原抗体的结合本质上只发生在抗原的抗原决议簇与抗体的抗原结合位点之间。抗原决议簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学构造和空间构型上呈互由于两者在化学构造和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反响具有高度的补关系，所以抗原抗体反响具有高度的特异性。特异性。 例如乙肝病毒中的例如乙肝病毒中的外表抗原外表抗原HBsAgHBsAg、e e抗原抗原HBeAgHBeAg和中心抗和

15、中心抗体体HBcAgHBcAg，虽来源于，虽来源于同一病毒，但仅与其相同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与应的抗体结合，而不与另外两种抗体反响。抗另外两种抗体反响。抗原抗体反响的这种特异原抗体反响的这种特异性使免疫测定能在一非性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物常复杂的蛋白质化合物例如血清中测定某例如血清中测定某一特定的物质，而不需一特定的物质，而不需先分别待检物。先分别待检物。ELISAELISA运用实例运用实例 饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定主要包括黄曲霉毒素，饲料中毒素的测定主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素简曲霉毒素 饲料中有害微生物的快速筛检

16、饲料中有害微生物的快速筛检 如沙门氏如沙门氏菌菌 甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析 ELISA在饲料平安检测中的运用在饲料平安检测中的运用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草剂与杀虫剂两大类主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松例如杀暝松 FN FN 、 甲氟磷酸异已酶甲氟磷酸异已酶 SOMAN SOMAN 、 草不绿草不绿 Alachor Alachor 、 西维因西维因 Carbaryl Carbaryl 、

17、多菌灵及克菌丹多菌灵及克菌丹 Captan Captan 等。等。农药的检测：农药的检测： ELISA ELISA检测检测 “非典型肺炎冠状病毒非典型肺炎冠状病毒 ELISA ELISA在结缔组织病早期诊断中的运用在结缔组织病早期诊断中的运用检测抗异质性胞核核糖蛋白检测抗异质性胞核核糖蛋白A2A2hnRNPA2hnRNPA2/ /类风湿性关节炎类风湿性关节炎PtAPtA3333抗体抗体ELISAELISA在疾病诊断中的作用在疾病诊断中的作用 ELISA ELISA法检测幽门螺杆菌抗体法检测幽门螺杆菌抗体ELISAELISA试剂盒商业资讯试剂盒商业资讯ELISA试剂盒试剂盒酶联免疫井酶联免疫井DNM-9602GDNM-96