月季抗白粉病基因Mlo的克隆和功能分析

1、月季抗白粉病基因 Mlo 的克隆和功能分析由白粉病菌(Podosphera pannosa)引起的白粉病害(Powdery mildew)是 全球切花月季( Rosa hybrida )生产的第一大病害 , 也是庭院月季和盆花月季的 主要病害之一。中国是全球蔷薇野生资源的分布中心之一 , 也是全球切花月季的 主产区之一 , 但是对蔷薇野生资源的优异性状或基因缺乏研究 , 从而制约了该类 资源在现代月季遗传改良中的应用。Mio基因是一类新发现的抗病基因，一些双子叶植物(如拟南芥、豌豆、番 茄)隐形突变的 Mlo 基因让其获得了广谱高抗的抗病性。 本研究以野蔷薇 (又称 多花蔷薇)( R.mult

2、iflora )及其杂交后代为研究材料 , 通过同源克隆法从中获得 4个Mio的全长c DNA和genomic DNA序列,再采用相关分析软件对这 4个目的 基因进行结构分析；然后以BC1(2n=2x)分离群体为材料,采用遗传连锁图谱技 术对4个候选基因进行定位分析；而后利用实时荧光定量q PCR技术分析4个目 的基因的时空表达规律；最后构建候选基因Rh MLO1的正义表达载体和反义抑制 载体, 分别转化白玉材料并获得转基因植株 ,比较转基因植株与对照植株白粉 病抗性上的差异 , 从“得”和“失”两个角度以及正反两面去验证该基因在月季 中的功能。本研究获得的结果和主要结论如下:1四个月季Mlo

3、基因的克隆与序列分析 以野蔷薇及其杂交后代为材料,采用RT-PCF和RACE等技术克隆得到四个月季白 粉病抗病候选基因的c DNA和g DNA全长序列,分别命名为Rh MLO1-Rh MLC。 Rh MLO1-Rh MLO四个基因的 c DNA全长分别为 1779 bp、1767 bp、1692 bp 和 1695 bp, 它们的最大开放阅读框分别编码 592、 588、 563和 564个氨基酸。其编码蛋白均包含7个跨膜结构域及两个典型的 MLO莫体结构,即Calmodulin-binding-site(Ca MBD和 C末端的 D/E-F-S/T-F 结构域。Rh MLO1-RhMLO4勺

4、蛋白分子量分别为 67.79 k Da、67.22 k Da、64.55 k Da 和 64.61 k Da, 理论等电点分别为 9.53、 8.96、 9.00 和9.26。RhMLO1-RhMLO划个基因的基因组序列长度分别为 6.1 kb、3.7 kb、9.3 kb和 3.5 kb, 序列分析显示这四个基因均包含 15个外显子和 14个内含子。上述研 究结果说明Rh MLO1-Rh MLO四个基因是Mio基因家族的新成员,同时也为进一 步研究这四个基因的结构和功能奠定了基础。用该四个基因所编码的蛋白序列与其他作物MLC蛋白序列进行比对,结果表明：月季的ML列与拟南芥、番茄、豌豆等双子叶植

5、物的同源关系更近,与大麦、 小麦、水稻和玉米等单子叶植物的亲缘关系更远 , 这一结果与植物学传统分类系 统一致。2四个月季Mio基因的遗传连锁图谱构建通过 PCR-SSC技术,利用Join Map2.0软件构建了四个Mio基因的遗传连锁图谱。结果表明:Rh MLO1基因定位在5号连锁群NBS104-31W CAg-ATg355-31两标记之间,Rh MLO2基因定位在3号连锁群上并与 重瓣花相关基因Blfo的遗传距离较近,Rh MLO3和Rh MLO4S因紧密连锁并定位 在1号连锁群上,该区域附近有月季黑斑病抗性相关基因和白粉病抗性相关数量 性状基因。这四个Mio基因的定位结果将对我们下一步利

6、用分子标记辅助育种的 实践工作具有重要的指导意义。3四个月季Mio基因的时空表达分析利用实时荧光定量 PCR技术,对四个目 的基因进行了时空表达分析。实验结果表明：Rh MLO1和Rh MLO2基因在不同组 织部位及不同胁迫中的表达模式趋于一致 , 两者在不同胁迫下均表现为积极响应 诱导上调 , 并且在受白粉病菌侵染的不同阶段均表现为表达量明显上调趋势因此,Rh ML01和Rh MLO2基因有可能在月季与白粉病菌互作的过程中扮演着重要角色。4候选基因Rh ML01的功能验证通过酶切和连接等步骤,分别构建 了月季Rh ML01基因的正义表达载体和反义抑制表达载体，并通过农杆菌介导法 分别对白玉植株材料的体细胞胚进行遗传转化。利用PCF法和FQ-PC法对转基因植株进行检测，结果表明目的基因已经整合 到转基因植株的基因组之中。 分别利用离体鉴定法和显微镜观察法对转基因植株 和对照植物进行白粉病抗