完整版蛋白纯化AKTA操作说明

1、AKTA pure操作说明分子筛层析操作步骤：1 .开机：打开AKTA pure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音） 。2 .打开系统：打开电脑：双击 Unicorn 7.0打开系统，进入10g on界面，用户名默认为 Default,输 入密码：default,点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。注意：进入系 统时会弹出 三个界面：System Control界面， Evaluation界面和 Administration界面。其中system Control界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在 该界面下完成： Manual-Execute Manual instru

2、ctions- ; Evaluation 界面为结果数 据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn 7.0系统设置界面。3 .洗泵：把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在 System Control 界面下，点击 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash- 点 开 inlet,选择 A1-Excuse。4 .设置系统参数：设柱压： Alams-alam systerm pressure-high alam- 设置柱压 -Execute ;设流速： Pumps-System f

3、low -设置 system flow （1mL/min ） -Execute o 注意：流速和柱压设置参照“ GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。5 .装柱子（先上后下）：接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开 柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口 ；接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液 体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。6 .平衡柱子：分子筛buffer平衡柱子，一般要两个小时左右，盐离子浓度达到5.5%左右。7 .设置系统及收集参数：命 名：先 end-Manual instru

4、ctions ,点击 browse,弹出 select result name&location 界 面，点开文件夹“defaultHome”,找到文件夹“labdata”,点开，选择自己名字 首字母缩写文件夹（已创建），在界面下方“ name”指令框进行命名。注意：命名时要标明 日期，柱子型号，样品名称。设流速： Pumps-System flow-设流速（1 mL/min ） -Execute ;设柱压： Alams- alam systerm pressure-high alam- 设置柱压-点击 Execute;洗 A 泵：Pumps-Pump A wash-点开 inlet,

5、选择 A1-Excuse ;紫外调零：Monitors-Auto zero UV-Execute ;设置收集体积：Fracton collection-peak fractionation-fraction size-设置收集体积-Execute;一般设为1 mL（可根据实际情况调整）。设置收集水平：Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level- 设置起始收集水平-Execute。注意：对于初次纯化的蛋白，由于蛋白含量未知，起始水平可设低些， 如10 mAU,避免损失蛋白。8 .上样：冲洗Loop环：取5mL注射器，吸

6、取5 mL分子筛（不能有气泡），从进样口注射 2倍 Loop体积的分子筛来清洗 Loop环；蛋白样品处理：取出蛋白样品（ 2 mL）, 12000 rpm离心3 min ,把上清转移至新的离 心管管，重复一次，以去除沉淀，避免堵塞系统；手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内，从进样口把样品注射入 Loop环内；注意：上样时应小心操作，首先弹出注射器内的气泡，随后稍推注射器，使注射器出口处悬挂一样品液滴（别太用力，导致液滴滴落），然后把注射器插入进样口，把蛋白样品推入Loop环中。Inject:点击 Flow path-injection valve- 点开 position 选项-inject

7、-Execute- 走 2 倍 Loop 体积的分子筛缓冲液；Load:点击 Flow path-injection valve- 点开 position 选项-manual load-Execute , 调回 Load状态。9 .收集目标蛋白：参照标准蛋白曲线，估计样品出峰位置，收集蛋白样品，做好标记，过完后，peak fracstop 900停止收集。10 . 20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出来，离子浓度平衡后，点击pause,进分子筛的buffer的泵头用去离子水洗，放入20%的乙醇中，continue-洗泵（A1泵），平衡柱子。20%的乙醇平衡柱子， 一般要两小时左右，盐离子浓度达到0

8、%。11收柱子（先下后上）：调节流速至0.5 mL/min ,拧下柱下面的接头，连上注射器，再调流速至1 mL/min ,注射器内吸入3-5 mL 20%乙醇，取下柱上面的接头看是不是往外流液体，因为注射器内 有压力，液体会倒流，盖子内滴满液体，立即拧上盖子，防止进气泡，将进样阀的线接 到检测器上。12 .关闭系统：点击End关闭系统界面，关闭 AKTA pure电源，关电脑。AKTA pure操作说明离子交换蛋白纯化步骤（RESOURCE Q/S ）1 .开机：打开AKTA pure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。2 .打开系统：打开电脑：双击 Unicorn 7.0打开系统

9、 进入log on界面，用户名默认为 Default,输入密 码：default,点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。注意：进入系统时会弹出三个界面：System Control界面，Evaluation界面和Administration界面。其中system Control界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成： Manual-Execute Manual instructions- ; Evaluation 界面为结果数据查看及处理窗口； Administration界面为 Unicorn 7.0系统设置界面。3 .洗泵：点击pause暂停系统-去离子水冲洗 A1,

10、B1进液泵头-分别放入A, B液中；洗 B 泵： 选择 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-点开 inlet,选择 B1-Excuse ;洗 A 泵： 选择 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-点开 inlet,选择 A1-Excuse,洗泵结束后调 B 至 100%, 0min-Execute。4 .设置系统参数：设柱压： Alams-alam systerm pressure-hi

11、gh alam-设置最高柱压 -Execute o 设流速： Pumps-System flow-设置 system flow 11 mL/min ） -execute;注意：流速和柱压设置参照“ GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。5 .安装RESOURCE柱（先上后下）：装离子柱时先拧开离子柱上面， 连上来自进样阀的线， 边拧紧上面边拧松柱下面， 在离 子柱子下端出口连上转接头， 接上一根较短的先并连到检测器上 （流出液体，滴满检测 器上的连接口的洞里，再拧紧）。6 .平衡 RESOURCE 柱：等 B 液平衡后，点击 Pumps-gradient-Target-调 B 至 0%, 0m

12、in-Execute。等平衡后， 记录最高和最低盐离子浓度：离子交换 B液盐离子浓度约为 84%,离子交换 A液盐离 子浓度约为1.7%。7 .设置系统及收集参数：命 名：先 end-Manual instructions，点击 browse,弹出 select result name&location 界面， 点开文件夹“defaultHome”,找到文件夹“labdata”,点开，选择自己名字首字 母缩写文件夹（已创建），在界面下方“ name”指令框进行命名。注意：命名时要标明 日期，柱子型号，样品名称。设流速： Pumps-System flow-设流速（1 mL/min -

13、-Execute;设柱压： Alams-alam systerm pressure-high alam- 设置柱压 -点击 Execute;紫外调零：Monitors-Auto zero UV-Execute ;设置收集体积：Fracton collection-peak fractionation-fraction size-设置收集体积 -Execute；一般设为1 mL （可根据实际情况调整）。设置收集水平：Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level- 设置起始收集水平-Execute。注意：对于初次纯化的蛋白

14、，由于蛋白含量未知，起始水平可设低些， 如10 mAU ,避免损失蛋白。8 .上样：冲洗Loop环：取5 mL注射器，吸取5 mL分子筛（不能有气泡），从进样口注射 2倍 Loop体积的分子筛来清洗 Loop环；蛋白样品处理：取出蛋白样品（ 2 mL）, 12000 rpm离心3 min ,把上清转移至新的离 心管管，重复一次，以去除沉淀，避免堵塞系统；手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内，从进样口把样品注射入Loop环内；注意：上样时应小心操作，首先弹出注射器内的气泡，随后稍推注射器，使注射器出口处悬挂一样品液滴（别太用力，导致液滴滴落），然后把注射器插入进样口，把蛋白样品推入Loop环中

15、。Inject:点击 Flow path-injection vake-点开 position 选项-injectexecute-走 2 倍 Loop体积的分子筛缓冲液；Load:等流穿峰出来后，点击 Flow path-injection vake-点开 position 选项-manual load-Execute ,调回 Load 状态。注意：流穿峰蛋白先别丢弃，它有可能是样品没有挂上柱子而直接流出来的目标蛋白。9 .洗脱目的蛋白：Pumps-Gradient target 50% , length 50 min （可调）-Execute ,自离子柱上洗脱结合的 蛋白10 .收集目标蛋白：收集洗脱下来的蛋白样品，做好标记，过完后，peak fracstop 900停止收集。11 . B液平衡离子柱：Pumps-Gradient target 50% , length 0 min- Execute ,至盐离子浓度达到最高且平衡。如继续纯化其他蛋白样品：要用A液再平衡后再上样，步骤同上1-11。如不再纯化其他蛋白样品：点击pause暂停系统-去离子