分子生物学实验实验操作ppt课件

1、基因、载体、受体菌株基因、载体、受体菌株基因基因载体载体菌株菌株质粒质粒酶切衔接酶切衔接转化转化质粒提取质粒提取PCRPCRv应掌握的实验技术应掌握的实验技术v酶切酶切,衔接衔接v凝胶回收凝胶回收v制备感受态细胞制备感受态细胞v质粒提取质粒提取vPCRv琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳v调查目的调查目的v电泳电泳v电泳电泳v感受态细胞转化感受态细胞转化率率v电泳电泳v电泳电泳v电泳电泳rhIL-18rhIL-18基因的基因的PCRPCR产物产物质粒质粒pUC18pUC18BglBgl和和PstPst双双酶切酶切BamHBamH和和PstPst双双酶切酶切浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳

2、凝胶回收凝胶回收配制配制 LB LB 液体与固体平板培育基液体与固体平板培育基灭菌灭菌凝胶回收与溶液回收凝胶回收与溶液回收电泳检验电泳检验T4T4衔接酶衔接过夜衔接酶衔接过夜E .coli DH5E .coli DH5菌株菌株 37 37过夜培育过夜培育提取质粒提取质粒DNADNA浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCRPCR浓度浓度1%1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳v rhIL-18的PCR产物v PCR产物 10L v Buffer O 2Lv 无菌水 7Lv Bgl 0.5Lv Pst 0.5Lv 质粒pUC18v 质粒 10Lv BamH Buffer 2Lv 无菌水 6.

3、7Lv BamH 0.3Lv Pst 1L37酶切反响3小时。v LB液体培育基v 每1L配量：v 蛋白胨 10gv 酵母提取物 5gv 氯化钠 5gv 调理pH到7.0v LB固体培育基:v 每100ml液体培育基添加1.5g琼脂v 每组预备：v 1个30ml 液体培育基灭菌灭菌v1个30ml LB 液体培育基v微量移液器枪头200uLv琼脂糖凝胶电泳是分别鉴定和纯化DNA 片段的规范方法。 vDNA 的分子大小v琼脂糖浓度 vDNA 分子的构象v电源电压 v嵌入染料的存在 v离子强度影响琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：运用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒分别对： 目的基因片段0.5Kb片

4、段溶液回收 载体片段2.7Kb片段进展凝胶回收1.经过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他片段尽能够分开，然后用干净的手术刀切下含需回收DNA的琼脂块，放入Ep管。2.按300L/100mg3:1的比例参与 Binding Buffer，置于50-60水浴中10min，使凝胶彻底融化。期间，每2 min混匀一次。3.将融化的溶胶液转移到套在 2-ml 搜集管的UNIQ-10柱中，室温放置 2 min。12000 rpm 室温离心 1 min。4.取下UNIQ-10柱，倒掉搜集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个搜集管中，参与500L Wash Solution，12000 rpm 室温离心

5、 1 min。5.反复步骤4一次。6.取下UNIQ-10柱，倒掉搜集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放入同一个搜集管中，12000 rpm 室温离心 2 min。7.将 UNIQ-10 柱放入一根新的 Ep 管中，在柱子膜中央加30L Elution Buffer，60放置 5min。8.12000 rpm 室温离心 1 min ，离心管中的液体即为回收的DNA片段。从溶液中回收DNA： 根据溶液的体积，参与 3 倍体积的 Binding Buffer混匀。 以下操作参照琼脂糖凝胶中回收DNA步骤3-8. 计算基因与载体片段比例计算基因与载体片段比例v紫外下察看基因与载体片段的亮度紫外下察看

6、基因与载体片段的亮度v基因的摩尔数基因的摩尔数基因片段亮度基因片段亮度/碱基数碱基数495bpv载体的摩尔数载体的摩尔数载体片段亮度载体片段亮度/碱基数碱基数2700bpv基因摩尔数基因摩尔数/载体摩尔数载体摩尔数 最正确比例是最正确比例是3：1 在灭菌的在灭菌的0.2mL离心管离心管PCR管中进展管中进展 20L体积反响体系中：体积反响体系中： 10快速衔接缓冲液快速衔接缓冲液 2L rhIL-18双酶切产物双酶切产物 X L 质粒质粒pUC18双酶切产物双酶切产物 Y L T4-DNA衔接酶衔接酶 1L201h，4 过夜过夜1E.coli DH5菌株菌株37过夜培育以复苏菌种，取过夜培育的

7、菌液过夜培育以复苏菌种，取过夜培育的菌液0.3mL参与到参与到30 mL LB培育基中，培育基中，37，230 r/min振荡培育振荡培育3 h，至至OD600约为约为0.4左右。左右。2无菌条件下，将无菌条件下，将50mL菌液转移至离心管中，冰上放置菌液转移至离心管中，冰上放置10 min，使培育物冷却至使培育物冷却至0。3在预冷在预冷4的离心机上以的离心机上以4000r/min离心离心10min，弃去上清，参与，弃去上清，参与30mL预冷的预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴上放置溶液重悬沉淀，冰浴上放置10 min。4以以4000r/min在在4离心离心10min，弃去上

8、清，每，弃去上清，每30mL初始培育物初始培育物用用1.0mL预冷的预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬细胞沉淀，溶液重悬细胞沉淀，200L/管分装。管分装。1向分装有向分装有200LE.coli DH5菌株感受态细胞的菌株感受态细胞的EP管中管中参与参与10L的上步中得到的衔接混合物，悄然旋转以混合内的上步中得到的衔接混合物，悄然旋转以混合内容物，冰浴上放置容物，冰浴上放置30 min。2将该将该EP管放入预加温至管放入预加温至42的水浴中，放置的水浴中，放置90s，快速，快速转移到冰浴中，使细胞冷却转移到冰浴中，使细胞冷却12 min。 3向向EP管参与管参与800 L LB培育基，转

9、移至培育基，转移至37摇床上，摇床上，150r/min，温育，温育45 min以复苏菌株。以复苏菌株。4将将200L上述培育物加到含上述培育物加到含100g/mL氨卞青霉氨卞青霉素的素的LB平板上，以玻璃涂布棒悄然地将转化细胞平板上，以玻璃涂布棒悄然地将转化细胞平铺于琼脂平板外表。平铺于琼脂平板外表。5将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，皿，37过夜培育，挑选鉴定。过夜培育，挑选鉴定。1 将过夜培育的12ml细菌12,000rpm离心1 min，彻底去除上清。2 参与250l Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。3 参与250 l

10、Solution II，立刻温暖混匀倾斜45度角，顺一个方向，渐渐旋转离心管，使细菌裂解，室温放置2分钟。4 参与350l Solution III，立刻上下颠倒510次，使之充分中和，室温放置5分钟。5 12,000rpm，离心10分钟。6 将步骤5中上清转移到套放于2.0ml搜集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2 min后，8,000rpm室温离心1 min。7 弃搜集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支搜集管中，汲取500l Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000rpm室温离心1 min。8 反复步骤7。9 弃搜集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支搜集管中

11、，12,000rpm室温离心2 min以彻底去除Wash Solution。10 将UNIQ-10柱放入新的干净1.5ml离心管中，加30l Elution Buffer，60放置10 min后，10,000rpm室温离心1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。1、调整模板、调整模板 待鉴定质粒浓度至待鉴定质粒浓度至 5 ng/ L2、按以下体系配制反响混合液，混匀，、按以下体系配制反响混合液，混匀， Template DNA 1.0 L 10 PCR buffer 2.0 L MgCl225mmol/L 1.5 L M13 Primer M4 (10mol/L) 0.5 L M13 Primer RV(10mol/L) 0.5 L dNTPs 2mmol/L 2.0 L Taq酶酶 5U/L 0.5L 加加ddH2O至至 20L外源基因的特异引物：外源基因的特异引物：引物引物M13 Primer M4:5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3 引物引物M13 Primer RV: