第21章：免疫学检测及相关实验技术

1、免疫学检测及相关实验技术免疫学检测及相关实验技术第第 21 章章 免疫学检测是应用免疫学理论设计的一免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。技术在免疫学研究中的应用。 免疫学技术的应用极为广泛免疫学技术的应用极为广泛, , 疾病的诊疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。断、疗效评价及理论研究等。 第一节第一节 免疫学检测原理免疫学检测原理u 细胞水平检测细胞水平检测u 分子水平检测分子水平检测u 基因水平检测基因水平检测一、免疫细胞的检测一、免

2、疫细胞的检测 对机体参与免疫应答的细胞进行对机体参与免疫应答的细胞进行分离、纯化、鉴定、计数及功能分离、纯化、鉴定、计数及功能测定。测定。 ( (一一) ) 免疫细胞分离与纯化免疫细胞分离与纯化(1) 抗凝抗凝静脉血静脉血(2) 加等加等量量NS(4) 密度梯度离心密度梯度离心血浆血浆分离液分离液RBCPBMCPMN(3) 混匀后，缓混匀后，缓慢加于分离液上慢加于分离液上利用表面标志分利用表面标志分离淋巴细胞亚群离淋巴细胞亚群流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry, FCM)流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理FACS细胞分选细胞分选FACS 技术分析技术分析用抗用抗IgMIgM单

3、抗分单抗分离离B B细胞克隆细胞克隆Removal of T cells from marrow graft MagnetMagnetic antibodies( (二二) ) 免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定 1. T1. T细胞功能测定细胞功能测定 可分为非特异性丝可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。裂原和特异性抗原两类。 * * 丝裂原主要有丝裂原主要有PHAPHA、Con ACon A和和PWMPWM； * * 抗原刺激物有破伤风类毒素、抗原刺激物有破伤风类毒素、PPDPPD和白色念和白色念珠菌等；珠菌等； * * 同种同种MHCMHC及抗及抗CD3CD3单抗等单抗等 * * 肿瘤细

4、胞肿瘤细胞- -自体淋巴细胞混合培养自体淋巴细胞混合培养淋巴细胞转化试验（形态学示意图）淋巴细胞转化试验（形态学示意图） PHAPHA刺激刺激4872小时小时培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（淋巴细胞增殖试验（3 3H-TdRH-TdR掺入法）示意图掺入法）示意图靶细胞靶细胞51Cr洗涤洗涤去除游离去除游离的的5151CrCr效应细胞效应细胞测量上清液中测量上清液中释放的释放的5151CrCr混合培养混合培养4-6小时小时细胞毒试验（细胞毒试验（5151CrCr释放法）释放法） * * 移植物抗宿主反应移植物抗宿主反应(GVHR) (GVHR) *

5、* 迟发型超敏反应迟发型超敏反应(DTH) (DTH) 2. B2. B细胞功能测定细胞功能测定 ( ( 一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。的体外实验方法。 溶溶血血空空斑斑实实验验ELISPOT实验实验 稳定、特异，且抗原用量少稳定、特异，且抗原用量少可同时检测不同抗原诱导的可同时检测不同抗原诱导的 抗体分泌，并可定量检测抗体分泌，并可定量检测可检测组织切片中分泌抗体的可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞单个细胞3. 3. NKNK细胞活性测定细胞活性测定 用放射性核素用放射性核素( (5151CrCr、125125I I Ud

6、R)UdR)标记靶细胞标记靶细胞测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶( (LDH)LDH)活性活性 4 4吞噬细胞功能测定吞噬细胞功能测定 滤膜渗透法滤膜渗透法(Boyden(Boyden小室法小室法) ) 1) 1) 显微镜检法显微镜检法 2) NBT2) NBT试验试验 3) 3) 化学发光测定法化学发光测定法u 免疫球蛋白的测定免疫球蛋白的测定u 补体测定补体测定u 细胞因子及其受体检测细胞因子及其受体检测u 黏附分子的检测黏附分子的检测二、免疫分子的检测二、免疫分子的检测细胞因子及其受体的检测细胞因子及其受体的检测 l 生

7、物学测定法生物学测定法l 免疫学检测法免疫学检测法l 分子生物学测定法分子生物学测定法l 细胞因子受体检测的基本技术细胞因子受体检测的基本技术 根据细胞因子对特定的生物学活性根据细胞因子对特定的生物学活性, ,应应用相应的指示系统用相应的指示系统, ,同时与标准品对比同时与标准品对比测定测定, ,从而得知样品中细胞因子的活性从而得知样品中细胞因子的活性水平水平, , 一般以活性单位一般以活性单位(U/ml)(U/ml)表示。表示。生物学测定法生物学测定法1 1、促进细胞增殖和增殖抑制法、促进细胞增殖和增殖抑制法 3 3H-TdRH-TdR掺入法、掺入法、 比色法（比色法（ MTTMTT、WST

8、-1WST-1） 染色法染色法 直接计数法直接计数法2 2、细胞毒活性测定法、细胞毒活性测定法 5151CrCr释放释放 比色法（比色法（ MTTMTT、WST-1WST-1）3 3、集落形成法、集落形成法4 4、细胞病变抑制法、细胞病变抑制法5 5、趋化活性测定法、趋化活性测定法 免疫学检测的基本原理是将细胞因子作免疫学检测的基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISAELISA法、法、RIARIA法和免疫印迹法等均已用法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。某些细胞因子含量于细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的样品甚微的样品( (如

9、脑脊液如脑脊液) )可用免疫聚合酶可用免疫聚合酶链反应链反应(immuno-PCR)(immuno-PCR)进行检测。进行检测。免疫学检测法免疫学检测法分子生物学测定法分子生物学测定法 RNARNA印迹法、核酸酶保护分析、原位杂印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交、交、PCR和和Real Time PCR等。亦可通等。亦可通过检测细胞内细胞因子的基因组成或过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNAmRNA量，推算出细胞因子的合成量。量，推算出细胞因子的合成量。 CKR检测的基本技术检测的基本技术 细胞因子的广泛生物学活性是通过与细胞因子的广泛生物学活性是通过与各自相应的受体结合而发挥的。因此各自相应

10、的受体结合而发挥的。因此细胞因子受体的检测与细胞因子检测细胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，已成为基础理论和临床免疫学一样，已成为基础理论和临床免疫学研究的一个重要内容。研究的一个重要内容。 粘附分子的检测粘附分子的检测 某些粘附分子除表达于细胞膜表面外，某些粘附分子除表达于细胞膜表面外，还以可溶性形式存在于体液中。粘附还以可溶性形式存在于体液中。粘附分子的检测方法目前大多采用免疫学分子的检测方法目前大多采用免疫学技术检查其在细胞膜上的分布和测定技术检查其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。某些样品中的含量。三、免疫相关基因检测三、免疫相关基因检测 * * 包括各种类型的杂交技术，如转印

11、杂交、包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、斑点杂交、原位杂交等以及斑点杂交、原位杂交等以及PCRPCR技术等。技术等。 * * 杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一段用放射性核素或其他标记物段用放射性核素或其他标记物( (生物素、荧光生物素、荧光素、地高辛等素、地高辛等) )标记，并与目的基因互补的标记，并与目的基因互补的DNADNA片段或单链片段或单链DNADNA、RNARNA。分为。分为cDNAcDNA探针、寡探针、寡核苷酸探针、基因组核苷酸探针、基因组DNADNA探针及探针及RNARNA探针等。探针等。细胞因子基因组细胞因子基因组DNADNA或或mRN

12、AmRNA的检测的检测 1. Northern1. Northern杂交分析杂交分析 2. 2. 斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交: : 将将DNADNA变性后直接点变性后直接点样于硝酸纤维膜上再进行杂交样于硝酸纤维膜上再进行杂交 3. 3. 原位杂交法原位杂交法 4. PCR4. PCR扩增产物杂交分析：扩增产物杂交分析：将细胞因子的将细胞因子的mRNAmRNA经过逆转录为经过逆转录为cDNAcDNA，用特异性细胞因子引物进，用特异性细胞因子引物进行行PCRPCR扩增，通过扩增，通过Southern blotSouthern blot后，再用标记后，再用标记探针检测特异细胞因子探针检测特

13、异细胞因子DNADNA的水平。的水平。 5 5SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 BCRBCR及及TCRTCR克隆性基因重排分析克隆性基因重排分析1 1SouthernSouthern印迹杂交法：印迹杂交法： 仅适用于科研，而不适用于临床诊断。仅适用于科研，而不适用于临床诊断。2. PCR2. PCR扩增技术扩增技术: : PCRPCR扩增技术扩增技术: :正常多克隆淋巴细胞群正常多克隆淋巴细胞群DNADNA的扩的扩增产物含有不同长度的片段，电泳检查呈现弥增产物含有不同长度的片段，电泳检查呈现弥漫涂片状结构或多条带。而单克隆性基因重排漫涂片状结构或多条带。而单克隆性基因重排经经P

14、CRPCR扩增后，产生明显相同长度的片段，电扩增后，产生明显相同长度的片段，电泳呈现单一紧密折带状结构。泳呈现单一紧密折带状结构。应用应用PCR PCR 扩增技术进行基因诊断具有特异、扩增技术进行基因诊断具有特异、敏感敏感(1/10(1/104 41/101/105 5克隆性细胞克隆性细胞) )、快速、快速(24h(24h可可完成完成) )等优点。等优点。用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断以用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断以及白血病治疗后微小残留病灶的检测。及白血病治疗后微小残留病灶的检测。 HLAHLA基因分型技术基因分型技术1 1序列特异性寡核苷酸探针序列特异性寡核苷酸探针PCR(PCR

15、-SSOP)PCR(PCR-SSOP)或或PCR-ASO:PCR-ASO:应用最多的一种简单、快速而又精确的应用最多的一种简单、快速而又精确的HLA-HLA-类抗原类抗原分型方法，能鉴定所有已知序列的分型方法，能鉴定所有已知序列的HLA-DRHLA-DR、DQDQ、DPDP等等位基因，精确地分析位基因，精确地分析DNADNA的多态性。的多态性。2 2限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)(PCR-RFLP)技术：技术：此项技术此项技术特别适用于个别标本和小样本的检测。特别适用于个别标本和小样本的检测。3 3单链构象多态性单链构象多态性PCR ( PCR-SSCP ) P

16、CR ( PCR-SSCP ) ：藉此可鉴别编藉此可鉴别编码码HLA-HLA-类抗原基因的多态性。类抗原基因的多态性。 应用应用PCR-SSCPPCR-SSCP可以直接比较供、受体之间可以直接比较供、受体之间HLA-HLA-类基类基因是否完全一致，且可精确到因是否完全一致，且可精确到1 1 2 2个碱基之差，具有个碱基之差，具有相对简捷而精确的特点。在异基因骨髓移植的配型中相对简捷而精确的特点。在异基因骨髓移植的配型中已初步应用于临床。已初步应用于临床。4 4序列特异性引物序列特异性引物PCRPCR技术技术(PCR-SSP)(PCR-SSP)：该法操作简该法操作简单、快速、实验结果容易判断，杂

17、合子也很易检出。单、快速、实验结果容易判断，杂合子也很易检出。不足之处在于，为检出所有的等位基因必须用多个不足之处在于，为检出所有的等位基因必须用多个引物进行扩增。引物进行扩增。5 5指纹图谱指纹图谱 (PCR-fingerprinting)(PCR-fingerprinting)技术：技术：进行进行HLA-HLA-基因分型鉴定时，将供、受体的基因分型鉴定时，将供、受体的DNADNA扩增产物混合，扩增产物混合，电泳后得出一指纹图，再与二者各自的电泳后得出一指纹图，再与二者各自的PCRPCR指纹图指纹图谱进行比较，从中选择出指纹图一致的供、受体进谱进行比较，从中选择出指纹图一致的供、受体进行移植

18、。行移植。 * * PCR PCR指纹图谱在选择非亲缘关系的供、受体进行指纹图谱在选择非亲缘关系的供、受体进行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。6. SNP(6. SNP(单个核苷酸多态性单个核苷酸多态性) )分析分析四、免疫标记技术四、免疫标记技术 u 免疫荧光技术免疫荧光技术 u 放射免疫分析法放射免疫分析法 u 酶免疫技术酶免疫技术u 发光免疫测定发光免疫测定 Ag* Ab Ag 标记抗原标记抗原 特异性抗体特异性抗体 待测抗原待测抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗体复合物抗原抗体复合物分离分离Ag*-Ab 和游离和游离Ag*从

19、标准曲线上读知含量从标准曲线上读知含量测定测定Ag*-Ab和和/或游离或游离Ag*放射性放射性 放射免疫测定法放射免疫测定法(RIA)(RIA)示意图示意图l 形态学方法形态学方法l普通光学显微镜检测法普通光学显微镜检测法l荧光显微镜检测法荧光显微镜检测法 材料：材料：石蜡切片石蜡切片; ;冰冻切片冰冻切片; ;细胞学涂细胞学涂 方法方法: :电镜观察凋亡小体电镜观察凋亡小体l 生化学方法生化学方法l 免疫学方法免疫学方法l 末端标记法末端标记法细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 形态学方法：形态学方法： P IP I 染 液 ： 碘 化 丙 啶染 液 ： 碘 化 丙 啶 ( p r o p i d i u m ( p r o p i d i u m iodide,PI)iodide,PI)；核红色；核红色 DAPI DAPI染液；核蓝白色染液；核蓝白色 AO AO染液：核黄绿色染液