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1、免疫浊度分析技术免疫浊度分析技术 信阳职业技术学院信阳职业技术学院 药学与检验系药学与检验系 ?20世纪70年代建立。它是将液相内的沉淀试验与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。当可溶性抗原与相应的抗体特异结合，在二者比例合适、并有一定浓度的电解质存在时，可以形成不溶性的免疫复合物，使反应液出现浊度。这种浊度可用肉眼或仪器测知，并可通过浊度推算出复合物的量，即抗原或抗体的量。 免疫浊度测定是定量测定微量抗原物质一种高灵敏度、快速的自动化免疫分析技术 ,其应用广泛。 ? 免疫浊度分析方法类型免疫浊度分析方法类型 ?一、透射免疫比浊法 二、速率抑制免疫比浊法 三、散射免疫比浊法 四、免

2、疫胶乳浊度测定法 一、透射免疫浊度测定法一、透射免疫浊度测定法 原理：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液过量时，形成的复合物随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物质的含量。 技术要点： 1）抗原参考品及待测标本作适当稀释； 2）将待测标本和标准抗原液（5个浓度）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处检测各管吸光度；（ 3）以剂量-反应曲线求得标本中抗原的浓度。 方法评价： ?本法操作简便，结果准确，能用全自动化或半自动化仪器进行分析。 ?灵敏度低于散射比浊法，但比单扩散法高5-

3、10倍。 ?抗体用量较大，检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长。 ?不宜用于药物半抗原的检测。 二、散射免疫比浊法 ?1967年Ritchie等利用激光照射在液相中的抗原抗体复合物微粒上时，部分光线发生散射的原理，通过测量散射光的强度来得知待测抗原的量，这种比浊测定法称为散射比浊法 1977年Sternberg进一步发展建立了速率散射比浊法使微量抗原的定量测定得以快速灵敏地进行。 基本原理基本原理 ?散射比浊法是指沿水平轴照射的一定波长的光，通过溶液时光线被免疫复合物粒子颗粒折射，发生偏转，产生散射光。反应溶液中的悬浮分子，无论是固体或胶体粒子都可以是散射中心。当入射光通过时，如果颗粒直径比入

4、射光的波长小很多（入射光波长的1/101/20），则散射光在各个方向上的分布比较均匀，称为Rayleigh散射；粒径与入射光的比例增大，正向散射光强度趋于增强，当粒径略小于入射光波长时，称为Debye散射；如果颗粒直径接近或大于入射光波长时，则散射光呈明显的不均匀分布，称为Mile散射。 入射光波长越小，散射光越强； ?散射光强度与粒子的浓度和体积成正比； ?散射光强度随焦点至检测器距离的平方和而下降。 因此，在散射比浊中，增加抗原抗体复合物的体积，减少入射光的波长，将检测点尽可能地接近散射源并选择合适的检测夹角，都可使检测的灵敏度增加。由于散射比浊法测定的是散射光的信号，避免了透射光中所含有

5、的透射、散射甚至折射等杂信号成分的影响，因此，散射比浊法的灵敏性和特异性均好于透射比浊法。 ?散射比浊法类型散射比浊法类型 ?终点散射比浊法 速率散射比浊法 （一）终点散射比浊法（一）终点散射比浊法 ?抗原、抗体相遇后免疫沉淀反应立即开始，但反应达到平衡通常需 1030min。免疫浊度测定应在复合物聚合产生絮状沉淀之前进行，否则光散射值降低，影响测定结果。因此，终点散射比浊通常是在免疫反应进行到一定时间时测量其浊度，故亦可称为定时散射比浊 （二）速率散射比浊法（二）速率散射比浊法 ?速率散射比浊法是一种先进的动力学测定法，1977年由Sternberg首先用于免疫学测定。 所谓速率是指单位时间

6、内抗原与抗体反应的速度。 抗原与抗体结合形成免疫复合物的速度，在每个单位时间内是不相同的，在抗体过量的情况下，随着反应时间的延长，免疫复合物的总量逐渐增加，通常在 25s时出现一个反应最快的速率峰。峰值与抗原量呈正相关。 抗原抗体反应的速率变化抗原抗体反应的速率变化 散 射 光 强 度 到达峰值时间 time 三、速率抑制免疫比浊法 ?本法是一种竞争性结合或竞争性抑制试验，主要用于测定半抗原和药物等小分子物质。试剂中的特异性抗体是由半抗原与载体蛋白偶联后，免疫动物制备而成。 试验时先将一定量的已知半抗原 - 载体（大分子）与限量的特异性抗体发生反应，生成的免疫复合物可形成一定的速率散射峰值。

7、?当反应系统内加入待检标本时，其中所含的半抗原（小分子）与抗体竞争结合，使大分子的半抗原 - 载体- 抗体复合物的形成受到抑制，速率散射峰值降低，其降低程度与标本中的待测半抗原（或药物）成正比，根据标准曲线可计算出标本中待测物质的含量。 四、免疫胶乳浊度测定法四、免疫胶乳浊度测定法 原理： 将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，则使乳胶颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时，则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳凝集的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比。 ?五、免疫浊度分析的影响因素五、免疫浊度分析的影响因素 抗原抗体反

8、应的比例 ? 抗体试剂的质量 ? 抗原抗体反应的溶液 ? 增浊剂的作用 ?（一）抗原抗体反应的比例（一）抗原抗体反应的比例 ?浊度法中的免疫反应遵循抗原抗体反应的一般规律。免疫浊度测定的反应体系中必须始终保持抗体过量，以保证免疫复合物的生成量与浊度的改变一致，这是免疫浊度测定的基本原则。 抗体过剩必须适量，因此实验中掌握抗体的浓度是个关键。 为了减少非特异性浊度（为了减少非特异性浊度（“伪浊度伪浊度”）的出现，）的出现，还应对抗原（待测样品）进行适当的稀释。 （二）抗体试剂的质量（二）抗体试剂的质量 ?1抗体的质量：免疫比浊测定法要求抗体的特异性强，效价高，亲和力强。 2 抗体的类型 ：根据抗

9、血清来源的动物种类不同，抗体可分为R型（rabbit type）和H型（horse type）。 R型抗体是用于免疫比浊测定的较为理想的试剂。 （三）抗原抗体反应的溶液（三）抗原抗体反应的溶液 ?反应液对免疫复合物的形成也起重要作用。抗原抗体反应液的最适pH值为6.58.5，超过此限度则不易形成复合物，甚至可引起复合物解离。在一定范围内，离子强度大，复合物形成快；离子强度过低或无电解质存在，则不易出现可见的沉淀反应。离子的种类也可影响免疫复合物的形成，一般常使用磷酸盐缓冲液作为免疫浊度法的反应液。 （四）增浊剂的作用（四）增浊剂的作用 ?在反应体系中加入某些非离子型亲水剂，如聚乙二醇（poly

10、ethylene glycol,PEG）、吐温-20（tween-20）等，可以促进抗原抗体复合物的形成，增加反应浊度。 以PEG6000为最常用。 全自动的免疫浊度测定仪特点全自动的免疫浊度测定仪特点 ?速率散射或透射比浊； 抗原过剩检测； 自动控制系统，包括自动稀释加液和标本、试剂液面感应装置、试剂冷藏和反应控温系统； 自动监测系统，能对试剂、样品和仪器状态自动监测并及时报警； 数据处理系统，包括数据的计算、患者和测试资料的储存、实时质控等功能； 校准和定标程序。 六、免疫浊度测定法的应用 ?免疫浊度法早期主要用于血清、尿和脑脊液中蛋白质含量的测定。 近年来，随着免疫浊度测定仪性能的不断完善，免疫浊度法的检测范围不断扩大。 六、免疫浊度测定法的