超声对大鼠牙骨质修复过程中TGF_省略_OPG_RANKL表达比值影响_李晓彦

1、百度文库-让每个人平等地提升自我超声对大鼠牙骨质修复过程中TGF-B 1表达和OPG/RANKL表达比值的影响*李晓彦霍俊滨霍娜刘永召王晓玲 徐娟目录11超声对大鼠牙骨质修复过程中TGF-B1表达和OPG/RANKL表达比值的影响本【摘要】目的：研究超声在大鼠牙骨质修复过程中对转化生长因子- P 1 (TGF- B1)表达和骨保护蛋白、核因子- KB受体活化因子配体(OPG/ RAXKL)表达比值的影响。方法：选择32只健康雄性 Wistar大鼠建立正畸性牙根吸收动物模型，随机分为4组，每组8只，分别为空白对照组， 单纯加力组，自然修复组,超声修复组，其中用频率1. 5MHz，强度100MW/

2、 cm2的治疗超声对 超声修复组的实验牙在2周的修复期进行每天15min治疗超声照射。2周治疗结束后，取上颌第 一磨牙及其牙周组织，制作以上颌第一磨牙为中心的，近远中方向的组织切片，行TGF- Bl, OPG, RANKL,免疫组化染色，光镜观察并作免疫组化光密度分析，对实验结果进行单因素方差分 析。统计学意义。超声修复组OPG/ RANKL光密度值比值(1. 1126 ± 0.096),也明显高于自然修复组 (0. 7835±0. 067)差异有统计学意义。结论：超声通过上调TGF- B1表达，改变OPG/RANKL 的比值，促进牙骨质的修复重建。关键词:超声；牙根吸收：

3、牙骨质:TGF- Pl： OPG/ RANKL 中国图书分类号R782. 1 文献标识码A文章编号1009- 3761(2013)01- 0011-05Effects of ultrasound on the expressions of TGF-pl and OPG / RANKL ratio during cementum reconstruction pro cess in ratLI Xiao-yant HUO Jim -bin, HUO Na, LIU Yong-zhaot WANG X沁o-ling, XU Juan. (Department ofOrthodontics, Gen

4、eral Hospital of Chinese PLA, Beijing 100853, China)ce-Abstract Objective: To study the effect of ultrasound on the expressions of TGF-p 1 and OPG/RANKL in the ra mentum reconstniction process. Methods: 32 healthy male Wistar rats were established as animal models of orthodontic root resorption, and

5、 randomly divided into four groups(the control group, experimental group, natural recovery group, ultra- sound repair group) with 8 in each group. The ultrasound repair group were given 1.5MHz 100MW/cni- ultrasound irradia- tion for 15min per day in the two weeks of repair period. Upper first molar-

6、centered mesial-distal tissue slices were generat- ed from the upper first molars and pcridentium of the rats from each group. Specimen slices were analyzed with hema- toxylin-eosin staining, OPG. RANKL, TGF-p 1 immunohistochemistry, and optical microscopy. Analyses of densitometry, and one-way anal

7、ysis of variance were pciformcd. Results: expressions of TGF-p 1 densitometry of ultrasound repair group(0.24576±0.03183).(0.36228 ±0.02833)were significantly higher than natural repair group expressions of OPG/RANRLdensitometry ratios of ultrasound repair group(l.l 126±0.096) were si

8、gnificantly higher than natural repair group (0.7835± 0.067). Conclusion: ultrasound promoted the repair and the reconstniction ofcemcntum by increasing the expressions ofTGF-pi and OPG/RANKL ratios. Key words: ultrasound; root resorption; cementuni; TGF-p 1; OPG/RANKL 基金项目：全军医学科技“十二五”科研项目（项目编号

9、：CWS1U117）牙根吸收是正畸治疗的常见并发症，发生率在学院军事兽医研究所）腹腔注射麻醉后仰卧固定，左右中切牙 远中轴角龈缘磨沟，由0. 012英寸（1英寸=2.54mm）银钛拉簧（圣玛特公司）加载于两颗中切牙与第一 磨牙之间，同一实验者用测力计（长沙天天齿科有 限公司）测力两次，确保初始力值100g，0. 20mm 结孔丝结扎，同时牙釉质粘结树脂增强固位。每天检 查弹簧，以防脱落。除10成IL牙根吸收的机理与的吸收基本类似， 由与破廿细胞形态和生物学功能相似的破牙骨质细 胞承担主要破牙竹质功能。与牙根吸收的这一破坏 性过程相伴随的是牙周膜组织的修复活动，当牙根 吸收的进程停止，破牙件质细

10、胞失去活性并从牙根 表面分离出去，成牙材质细胞开始进行修复活动， 类牙骨质修复基质沉积，钙化，新生牙骨质形成2,新生牙性质在吸收陷窝中沉积，牙周膜重建, 修复吸收所造成的缺损3。在这种吸收-修复转换的过程中，多种调控 因子共同参与成牙竹质细胞祖细胞的募集，表达， 分化，和牙骨质的修复。其中，竹保护蛋白（os- teopr oteger in OPG）、核因子- KB受体活化因 子配体（r eceptor activator nuclear factor kappaB ligand RANKL）.转化生长因子- B （transf orming growth factor- B TGF- B ）

11、 均参与这一过程并发挥其作用4。超声是一种辐射频率高于人类听觉范围的声波 轴射，以高频声学压缩波传导至人体组织，能在生 理和生物化学方而对细胞产生较大影响，并能作为 一种生物活性治疗工具5。在体外细胞实验中， 超声可影响多种细胞因子的表达；在骨科和齿科 领域，超声已被报道用于竹不连的位置增强骨形成6。 很多研究也显示超声能够抑制牙根吸收，并促进牙 骨质的修复，本研究对其机制进行深一步探讨。1 .材料和方法1. 1实验动物及分组选择8周龄的健康雄 性Wistar大鼠32只（解放军总医院实验动物中 心提供），将其按体重编号，并随机分为4组， 每组8只，分别为空白对照组，单纯加力组， 自然修复组，超

12、声修复组。2. 2动物模型的建立在健康雄性wistar大 鼠口内置入加力装置，在切牙与第一磨牙间置入银 钛 拉簧，施以100g力（1g=9. 8X10- 3N）,加力 2周，为牙齿加力期，建立正畸性牙根吸收模型: 后去除加力装置，观察2周，为牙根修复期，用以 观察牙根吸收陷窝的修复情况。动物模型建模标准 参照参考文献7。实验以大鼠右侧上颌第一磨牙 为实验牙，0. 7ml/ kg速眠新注射液（军事医学科空白对照组不接受任何处理，其余三组的大鼠 均在口内置入加力装置，加力两周后，单纯加力组 的大鼠断颈处死，取组织标本备用：自然修复组和 超声修复组的大鼠在加力两周后去除加力装置，在 加力侧第一和第二

13、磨牙之间填充自凝树脂材料，以 保持第一磨牙不再发生移动；超声修复组大鼠剃 去实验侧面颊部毛发，在2周的修复期每天用 频率L 5MHz,强度100MW/ cm2的低频超声治 疗仪（Smith & Nephew Medical Inc 型号 EXOGEN 2000+）紧贴实验侧皮肤（有效作用面积 4cm2）,照射 15mina3. 3组织标本制备加力2周后将动物断颈处 死取材，进行组织学分析。将标本固定于10%中 性缓冲甲醛溶液中48h,经15研DTA （乙二胺四乙酸） 溶液脱钙45d, 75与乙醇、85与乙醇、95舟乙醇、99. 9% 乙醇逐级脱水，二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋， 制作以上

14、颌第一磨牙为中心的近远中方向的4 um 厚的组织切片。4. 4 HE 染色，TGF- 3 1，OPG, RANKL 免疫 组化染色本实验采用TGF- Bl，OPG. RANKL多 克隆抗体（Santa Cruz,美国），SP免疫组化试剂盒 和DAB显色盒（北京中山生物公司），按说明书步骤 进行免疫组化染色，以PBS（pH7. 4的磷酸盐缓冲 液）代替一抗做阴性对照，选取大鼠远中第三牙根根 尖近中区，运用Imagepr 0- Plus 6. 0软件测量各 组 单个光镜视野（X400）下阳性产物的平均光密度 值。1. 5统计学分析 运用&SS 13. 0统计 软件对数据行单因素方差分析，采

15、用组间多重比较SNK- q 检验法。2 .结果组织学染色结果显示：牙根吸收主要发生 在牙根的受力侧。与自然修复组相比，超声修复组可见 增厚的修复性牙竹质（见图1 ）。空白对照组和自然修复组0PG表达为弱阳性， 单纯加力组和超声修复组0PG表达阳性（见图3）。 空白对照组和自然修复组RAXKL表达阳性，单 纯加力组RANKL表达强阳性，超声修复组RAN-KLA空白对照组：牙计 质完整连续，无 吸收陷窝B单纯加力组：部分牙骨质丧失，可见大量深而不规则的吸收陷窝表达弱阳性（见图4）oA空白对照组： 0PG表达弱阳 性B单纯加力组：B0PG表达阳性C自然修复组：牙的 质不连续，局部可见 少量新生牙骨质

16、形成D超声修复组：可见吸收陷窝中大量形成新生牙骨质j如箭头所示图1各组大鼠根尖近中区HE染色（X 100）免疫组织化学染色结果显示：TGF- Bl，OPG. RANKL阳性表达定位于细胞质，呈现棕黄色：牙周 膜，牙竹质以及竹吸收陷窝内的破件细胞均为阳 性表达部位。PBS代替一抗做阴性对照，未见阳性表达，空白对照组和单纯加力组TGF- P1表 达 阳性，自然修复组TGF- B1表达弱阳性， 超声修 复组TGF- P1表达强阳性（见图2）。C自然修复组：0PG表达弱 阳性D超声修复组： OPG表达阳 性图3各组大鼠根尖近中区0PG免疫组化染色（X400）A空白对照组： RANKL表达阳 性B单纯加

17、力组： RANKL表达强 阳性A空白对照组:TGF- 31表达阳性B单纯加力组:C力然修复组：TGF- 3114百度文库让每个人平等地提升白我1 四组大鼠根尖近中区TP B1平均光密度 值比较性破骨细胞数目增加转化生长因子- P 1 (TGF- B1)能够调节多种细胞15平光值 G匀度 OP士密分组TGF-P 1平均光密度值空白对照0. 28053±0.组单纯02615加力组0. 28141±0.自然修复02184组0. 24576 ±0.03183 a b超声修复组0. 36228±0. 02833 ab c注：a ：与空白对照组相比尸 0.01： b

18、：与单纯加 力组相比尸 0.01；c ：与自然修复组相比产( 0.01。表2四组大鼠第三牙根尖近中区CFG，RAXKL平均 光密度值比值比较RANKL 平 OPG/RANK均L光密度值比侑0.g白对照11529±0.010490. 10780.012470.华460. 02 4单纯加力0. 1320.2130. 621组自然31±08±4±0. 0060.0100. 05修复组55214 a超声修复0. 11583 ±0. 14819±0. 783组0.0110.0115±83047°b060. 1370. 124

19、04 ±97±1. 112黎be的生物学功能，不仅能够刺激成骨母细胞的增殖和 活化，促进成行形成，还可调行破骨细胞形成。在牙根吸收与修复这一过程中，TGF- B1公认是调 Vj OPG/ RANKL比值的上游信号，分别对破竹细胞 和成#细胞的分化形成起到重要的作用-11- 120超声能够增加生长因子和其他信号分子的合 成，骨源性分化和细胞外基质的生成13,这可能 是由于机械应力和/或作用于细胞膜，黏着斑， 细胞支架结构的液体微流动冲击力，触发细胞内 信号转换并诱导基因转录引起的。以往的体外细胞实验 研究表明：超声作用于成牙骨质细胞，不仅能增强 0PG的表达，还可影响其碱性磷

20、酸酶的mRNA表 达并增强细胞内钙含量U4,增强再矿化的进程； 超声作用于大鼠颅顶组织培养，能上调TGF- B 的表百度文库-让每个人平等地提升自我本研究通过观察大鼠牙根牙周膜中调控因 子的表达，来研究超声对牙竹质修复所 起到的作用及其可能存在的机制。实验 结果显示，与大鼠牙根吸收模型自然修 复两周相比较，使用频率为1. 5MHz, 强度100W/ cm2的超声作用于大鼠牙根 吸收模型2周后，大鼠牙根表而的牙竹 质修复明显增强。免疫组化染色结果显 示：单纯加力组TGF- P1的表达与空 白对照组相比，并未有明显改变。而单纯 加力组的OPG/ RANKL比值与空白对照 组相比，比值明显降低，差异

21、有统计学 意义。单纯加力组的OPG与RANKL的光 密度值要明显高于空白对照组，RANKL 的增长幅度更是显著高于OPG。说明在 大鼠牙根吸收过程中，OPG和RAXKL在 正畸力的作用下，表达发生改变，比值 降低，使牙周改建朝向吸收的方向进行 但TGF- 01表达无明显变化，由此可 推测，在大鼠牙根吸收过程中，TGF- B 1作为调行OPG/ RANKL比值的上游 信号，并未在OPG/RANKL比值的变化 中发生作用：与自然修复组相比较，超 声修复组的TGF- P1的表达明显增强 OPG/ RANKL比值也明0. 007120. 026650. 096注：a：与空白对照组相比尸< 0.0

22、1： b：与单纯加 力组相比/< 0.01；c：与自然修复组相比P< 0.01o统计学结果显示，超声修复组的TGF- P1 平均光密度值与自然修复组相比较，其差异具有 统计学意义。超声修复组的OPG/ RANKL平均光 密度 值比值要明显高于自然修复组，其差异具有 统计学意义。3 .讨论牙骨质是覆盖于牙齿表面的一薄层矿化组 织，协助牙齿固定于牙槽竹中，并有助于维持牙齿的结 构稳固和生理功能。牙骨质共享部分竹的特性，由 此表现出与骨在生物化学构成方面的显著相似。牙 骨质与竹的区别在于组织学上缺乏神经分布和血管 化8，此外与管相比，牙骨质的重建潜能是有 限的。对于正畸治疗导致的牙根吸收

23、或由于全身 系统性疾病导致的牙骨质丢失，如何促进牙骨质 的再生成为关注的重点。OPG, RANKL均是蛋白质配体，他是 同源的肿瘤坏死因子受体家族的成 员，功能是作为破竹细胞和田新陈 代谢的旁分泌调节器区。体内行量 的改变和破竹细胞的形成取决于 RANKL与OPG的比值，当这一平衡 倾向于OPG时，表现为活性破骨细 胞数目减少，当平衡倾向于RANKL 时，活16百度文库让每个人平等地提升白我PG表达的增强，以及RANKL表达的降低。4 .结论超声通过影响牙周膜中TGF-似表达，间接 作用于OPG/RANKL/RANK通路，上调OPG / RANKL比值，抑制破竹细胞的形成，刺激成牙 骨质竹细胞

24、的增殖和活化，促进了牙骨质修复。参考文献1 Pr eoteasa CT, Ionescu E. Pr eoteasa E. et al. Orthodontically induced root resorption correlated with morphological char- acter isticsJ. Rom J Morphol EnibryoL 2009, 50(2)： 257- 2622 Bosshardt D D. Are cemcntoblasts a subpopulation of os- teoblasts or a unique phenotypeJ. Jour

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