基因工程操作流程

1、为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢? 启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的共同顺序如下，-35区“AATGTGTGGAAT”，-10区“TTGACATATATT”。大多数启动子均有共同顺序（consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。终止子能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能编，能编码蛋白质码蛋白质 编码区:非编码区:原核细胞的原核细胞的基因结构基因结

2、构有调控作用，含启动子、终止子等。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子（二）真核细胞的基因结构（二）真核细胞的基因结构( (补补) )编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点

3、编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有调控和具有调控作用的作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码v目的基因主要指编码蛋白质的结构基因, 也可以是一些具有调控作用的因子。 基因文库的概念： 将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶载体载体受体菌受体菌存在于转化细菌内，由载体所携带的所有基因组DNA的集合。逆转录酶逆转录酶载体载体受体菌受

4、体菌PCR(polymerase chain reaction) 多聚酶链式反应是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。获取目的基因方法二：利用PCR技术扩增目的基因PCR扩增仪扩增仪原理：DNA双链复制反应过程： 利用PCR技术扩增目的基因DNA合成仪合成仪过程：适用范围： 已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。获取目的基因方法三：化学合成法小结:(1)从基因文库中获取适用于目的基因序适用于目的基因序列为未知的情况列为未知的情况(2)利用PCR技术扩增适用于目的基因的序列适用于目的基因的序列为已知的情况为已知的情况(3)人工合成适用于目的基因不是很

5、大且其适用于目的基因不是很大且其序列是已知的序列是已知的基因表达载体的组成基因表达载体的组成目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因等标记基因等标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的受体细胞 动物、植物、微生物动物、植物、微生物转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术3）将目的基因导入微生物细胞1）将目的基因导入植物细胞常用方法：-农杆菌转化法 适用范围： 双子叶植物和裸子植物1）将目的基因导入植物细胞基因枪法基因枪法

6、又称微弹轰击法，是籍高速度运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质转化技术。这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高此技术最早由我国学者周光宇提出的，植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。1）将目的基因导入植物细胞 花粉管通道法2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术3）将目的基因导入微生物细胞将重组表达载体将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细

7、胞态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收吸收DNA分子，完成转化。分子，完成转化。检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上上检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质检测方法：DNA分子杂交技术检测方法：分子杂交技术检测方法：抗原-抗体杂交DNADNA分子杂交技术分子杂交技术该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能编，能编码蛋白质码蛋白质 编码区:非编码区:原核细胞的原核细胞的基因结构基因结构有调控作用，含启动子、终止子等。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子v目的基因主要指编码蛋白质的结构基因, 也可以是一些具有调控作用的因子。 基因文库的概念： 将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因表达载