单基因遗传病的研究策略

1、研究策略与方法研究策略与方法v 临床诊断、家系调查与材料收集临床诊断、家系调查与材料收集v 侯选基因的确定侯选基因的确定v 已知致病基因突变位点的确定已知致病基因突变位点的确定v 连锁分析与未知基因的基因定位连锁分析与未知基因的基因定位v 基因型与表现型相关性研究基因型与表现型相关性研究v 发病机制的研究发病机制的研究临床诊断临床诊断 查阅相关资料，认识不同遗传病患者临床表现及其辅助诊断措施查阅相关资料，认识不同遗传病患者临床表现及其辅助诊断措施 临床诊断：症状和体征临床诊断：症状和体征 常规辅助检测指标常规辅助检测指标 特殊诊断指标特殊诊断指标家系调查与系谱分析家系调查与系谱分析 调查家系三

2、代以上所有相关成员的信息调查家系三代以上所有相关成员的信息 根据调查资料，用系谱中常用的符号绘制根据调查资料，用系谱中常用的符号绘制成系谱成系谱 系谱分析：区别遗传病与非遗传病系谱分析：区别遗传病与非遗传病 区别单基因与多基因病区别单基因与多基因病 判断遗传方式判断遗传方式大家系大家系散发病例散发病例临床遗传病家系特点临床遗传病家系特点 散发病例：对于遗传病，包括单基因遗传病，多数病例表现为散发。散发病例：对于遗传病，包括单基因遗传病，多数病例表现为散发。 小家系病例：在有家族史的病例中，多数也是小家系。小家系病例：在有家族史的病例中，多数也是小家系。 大家系病例：极少数家系发病个体多，涉及大

3、家系病例：极少数家系发病个体多，涉及3-43-4代都有患者。代都有患者。收集材料收集材料 采集样品：采集样品： 外周血，颊粘膜脱落细胞，毛囊, 病人组织（如可以取材）， 羊水（产前诊断） 采集家系应做到尽可能完整采集家系应做到尽可能完整 患者、同一家系中有相同遗传背景的表型正常的其他个体、该家系中其他遗传背景的成员收集临床资料收集临床资料 病人临床上一系列指标的检测 保存相关信息和影象资料 病人血清或组织的保存及其酶、病理或免疫学研究数据库数据库v 中的OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man ）数据库中整合了目前

4、已定位的单基因病的信息v 确定自己所研究家系的可能已知候选基因或已定位的染色体候选区域根据疾病名称检索根据疾病名称检索根据基因检索根据基因检索检索最新文献检索最新文献 获得已知基因基因组序列获得已知基因基因组序列 设计引物或参考文献中引物设计引物或参考文献中引物 根据文献，采用合适的技术方法进行基根据文献，采用合适的技术方法进行基因突变分析（在后面课程中详细介绍）因突变分析（在后面课程中详细介绍）从数据库中查阅目的基因从数据库中查阅目的基因的相关信息的相关信息 PCR-测序分析测序分析MFN2基基因因结果发现错义突变: c.281 GA,其所在密码子由CGG变为CAG, 导致其编码氨基酸由精氨

5、酸变为谷氨酰胺. 结论：经查阅文献资料， c.281 GA为已知致病突变位点，可判断其为该患者的致病突变位点。 根据变异导致的结果判断根据变异导致的结果判断 根据突变数据库和文献资料根据突变数据库和文献资料 排除已知排除已知SNPSNP 根据家系共分离与否判断根据家系共分离与否判断 在正常对照人群中分析在正常对照人群中分析 保守性分析保守性分析 基因功能分析基因功能分析突变分析结果的判断突变分析结果的判断注：适于分析较大的遗传病家系，不适于散发病例和小家系病例 连锁连锁 重组重组遗传标记遗传标记基因克隆基因克隆：确定致病基因基因例：一个例：一个X连锁肌肉病家系致病基因连锁肌肉病家系致病基因的定

6、位克隆研究的定位克隆研究 家系情况及前期研究基础家系情况及前期研究基础 先证者2临床表现近似DMD 排除了DMD/EMD/FHL1基因突变研究策略研究策略SNPSNP芯片分芯片分析析精细定位精细定位分析分析基因查阅基因查阅外显子组外显子组测序测序全基因组90万个SNP位点；8例样本；商业公司完成选取数个SNP点；增加3个成员连锁区域内的基 因 ： M a p Viewer；基 因 表 达 ：UniGene数据库及HGNC网站；基 因 功 能 ：OMIM数据库1例样本(I2)；商业公司完成SNP芯片数据分析 连锁分析 提示X染色体有三段连锁区域：单体型分析 Gene map locusGRCh3

7、7.p5 Primary Assembly (STS)P h y s i c a l distance (Mb)Genetic Distance(cM)Genetic Map(Marshfield)(cM) Xp22.32-p22.25,761,897-12,538,7316.785.0715.42-20.49 Xp21.2-p21.131,289,217-32,011,2660.720.5733.05-33.62 Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9515.2670.80-86.06三段连锁区域精细定位分析将Xp22.32-p22.2Xp22.32-p2

8、2.2连锁区域由6.78Mb 6.78Mb 缩短为4.18Mb4.18Mb 排除Xp21.2-p21.1Xp21.2-p21.1连锁区域肯定Xq24-q27.2Xq24-q27.2连锁区域最终确定两段连锁区域Gene map locusGRCh37.p5 Primary Assembly (STS)Physical distance(Mb)G e n e t i c Distance(cM)Marshfield(cM)Xp22.32-p22.25,761,897-9,946,6564.182.1015.42-17.52 Xq24-q27.2117,088,056-140,038,59422.9

9、515.2670.80-86.06 连锁区域内包含的基因Xp22.32-p22.2Xp22.32-p22.2连锁区域共28个基因：14个已知基因,14个预测基因14个已知基因： 6个基因在肌肉组织中表达 （3个基因表型已知，均与肌肉病无关） 7个基因不在肌肉组织表达 1个基因表达情况未知 Xq24-q27.2Xq24-q27.2连锁区域共272个基因：122个已知基因,150个未知基因122个已知基因： 79个基因在肌肉组织中表达 （18个基因表型已知，其中包括前期已经排除的FHL1基因） 41个基因不在肌肉组织表达 2个基因表达情况不清楚外显子组测序平均覆盖度：23.8 ；覆盖度大于20位点

10、占53.7%在上述两个连锁区域测序深度均很低对测序深度20的变异位点进行验证，结果均无变异存在的问题及解决办法本家系患者未进行肌肉活检将进行多个样本的外显子组测序Genotype和和Phenotype相关性研究相关性研究例：非综合征型先天缺牙的分子例：非综合征型先天缺牙的分子遗传学研究遗传学研究 J Dent Res, 2009; 88:126-131 Eur J Med Genet, 2008; 51: 536-546 Eur J Med Genet, 2011; 54: 377-382单基因遗传病发病机制的单基因遗传病发病机制的研究研究 隐性突变隐性突变往往导致失去功能（loss of f

11、unction） 显性突变可导致获得功能（gain of function）和失去功能 失去功能：单倍剂量不足（halpoinsufficency） 获得功能：显性负效应（dominant negtive） Gain of function ： Loricrin基因突变获得核转位的新功能基因突变获得核转位的新功能 Br J Dermatol, 2008; 159:714-719 Loricrin 角皮病角皮病连锁分析与连锁分析与1q21区域连锁区域连锁发现发现Loricrin基因新突变基因新突变特殊的临床表现特殊的临床表现突变蛋白序列新功能的预测突变蛋白序列新功能的预测GFP表达载体的构建表达

12、载体的构建细细胞胞亚亚定定位位分分析析动物模型动物模型 过表达和基因敲除小鼠模型均表现正常表型 转基因小鼠表现出与人类疾病相似的疾病表型，提示突变基因获得功能为其发病机制。基因敲除小鼠表型基本正常基因敲除小鼠表型基本正常转基因小鼠表型与人类疾病相似转基因小鼠表型与人类疾病相似结结 论论 Haploinsufficiency ： PAX6基因单倍剂量不足影响胰岛素基因单倍剂量不足影响胰岛素成熟过程导致糖耐受异常成熟过程导致糖耐受异常 Diabetologia. 2009; 52:504-13先天性无虹膜家系先天性无虹膜家系在该家系发现在该家系发现 PAX6 突变突变(c.1080CT)导致单倍剂

13、量不足导致单倍剂量不足 SSCP analysis DNA sequencing PAX6 基因及其基因及其 cDNAPAX6的功能的功能Hill et al. Nature 354, 1991;St-Onge et al. Nature 387, 1997; Sander et al. Genes Dev 11,1997PAX6 在胰腺发育中的功能在胰腺发育中的功能Mansouri et al. TEM 10, 1999Dohrmann et al. Mech Dev 92, 2000 PAX6 在成体胰腺中的功能在成体胰腺中的功能假假 说说 PAX6 mutation?abnormal g

14、lucose homeostasisOGTT Analysis in the Aniridia Pedigree 血糖和胰岛素水血糖和胰岛素水平平总结总结 1Aniridia caused by PAX6 gene mutation PAX6 mutation caused impaired glucose tolerance (IGT)PAX6-related IGT was associated with age 问问 题题Does IGT come from deficiency of insulin?Do these patients have insulin resistance?D

15、o patients have a defect in insulin processing? PAX6 Had No Effect on the Transcriptional Activity of the Insulin Promoter胰岛素耐受没有异常胰岛素耐受没有异常胰岛素原显著高胰岛素原显著高总结总结 2PAX6 had no effect on the insulin transcription IGT was not result from insulin resistanceIGT may come from a defect in insulin processingPC1 的功能的功能Proinsulin insulinin Pancreas POMC ACTHalpha-MSHin Hypothalamus Marcinkiewicz et al. Proc Natl Acad Sci 90, 1993 Naggert et al. Nature Genetics 10, 1995ACTH和和Alpha-MSH水平水平总结总结3 Deficiency of PC1 caused by PAX6 mutation was indicated假假 说说 PAX6 mutation?PC1deficiencyabnormal glucose home