pp基因工程的基本操作程序

1、目的基因的检测与及表达产目的基因的检测与及表达产物的测定物的测定基因工程的四大步骤：基因工程的四大步骤：目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1 1、什么是目的基因？、什么是目的基因？2 2、获取目的基因的方法有哪些？、获取目的基因的方法有哪些？从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNAcDNA文库）文库）基因文库的构建过程基因文库的构建过程基基因因组组文文库库限制酶限制酶供体细胞的供体细胞的全部全部DNA大量大量DNA片段片段拼接到载体上拼

2、接到载体上导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增PCRPCR的全称：的全称： 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR的原理：的原理： 体外的体外的DNADNA复制复制 模板模板原料原料引物引物酶酶控制温度控制温度目的基因目的基因DNADNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸某单链某单链DNADNA分子片段分子片段耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR仪自动调控仪自动调控PCRPCR的条件：的条件：PCRPCR的过程：的过程：变性变性(90-95)(90-95)复性复性(55-60)(55-60)延伸延伸(70-75)(70-75)cDNA基因文库的构建过程基因文库的构建过程mRNAmRNA单链

3、单链DNADNA 双链双链DNADNA逆转录逆转录cDNA文库（部分基因组文库）文库（部分基因组文库）依据目的基因的有关信息。依据目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。从从基因文库基因文库中分离获取目的基因中分离获取目的基因条件：条件：基因较小，核苷酸序列已知。基因较小，核苷酸序列已知。用切目的基因相用切目的基因相同的限制性内切同的限制性内切酶切割质粒酶切割质粒目的基因目的基因外显子内含子与RNA聚合酶结合位点编码区非编码区

4、非编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点编码区原核生物基因原核生物基因真核生物基因真核生物基因1 1、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因等标记基因等2 2、基因表达载体的构建目的：、基因表达载体的构建目的：a.a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。并且可以遗传给下一代。b.b.使目的基因能够表达和发挥作用。使目的基因能够表达和发挥作用。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞 1 1、目的基因导入植物细胞常用的方法、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？是什么

5、？具体过程是怎样的？ 2 2、目的基因导入动物细胞常用的方法、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？是什么？基本操作程序是怎样的？ 3 3、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？样的？钙离子有什么作用？1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞常用的方法常用的方法: : 农杆菌转化法、农杆菌转化法、基因枪法、基因枪法、 花粉管通道法花粉管通道法农杆菌的特点农杆菌的特点: :a.a.易感染双子叶植物和祼子植物。易感染双子叶植物和祼子植物。b.Tib.Ti质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可转移到受体细胞，可转移到受体细

6、胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上上三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞农杆菌转化法的导入过程农杆菌转化法的导入过程: :构建基因表达载体构建基因表达载体转入转入农杆菌农杆菌植物细胞植物细胞导入导入稳定维持和表达稳定维持和表达. .目的基因导入动物细胞目的基因导入动物细胞常用的方法常用的方法: : 显微注射技术显微注射技术操作程序：操作程序：三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞a.a.先提纯含目的基因的表达载体先提纯含目的基因的表达载体 b.b

7、.从动物体内取出卵从动物体内取出卵( (受精卵）受精卵）c.c.显微注射仪进行显微注射显微注射仪进行显微注射 d.d.将含目的基因的受精卵移植到输卵将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体管或子宫中发育成新个体3.3.目的基因导入微生物细胞目的基因导入微生物细胞原核生物的特点原核生物的特点: :繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。少。大肠杆菌的转化过程大肠杆菌的转化过程: :用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 增加细胞壁的透性，增加细胞壁的透性，与细胞膜无关与细胞膜无关三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞 感受态细胞感受态细胞重组表

8、达载体重组表达载体DNADNA分子与感受态细胞混合分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1 1、导入目的基因后需要检测哪些方面？、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？各采取什么方法？2 2、什么是、什么是DNADNA分子探针？检测时的分子探针？检测时的DNADNA探探针通过什么原理来检测目的基因和相针通过什么原理来检测目的基因和相应的应的mRNAmRNA？3 3、利用抗体抗原杂交检测的原理是什、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？么？目的基因的检测内容和方法目的基因的检测内容和方法四、目的基因的检测与鉴定四

9、、目的基因的检测与鉴定1 目的基因插入目的基因插入2 目的基因是否表达目的基因是否表达DNA分子杂交技术分子杂交技术 基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。测核酸样品中特定基因顺序的探测。 满足：（满足：（1）必须是单链，（）必须是单链，（2）带有容易）带有容易被检测出来的标记物。被检测出来的标记物。3.在遗传工程技术中在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得法获得 ( )A.人的胰岛素基因

10、人的胰岛素基因 B.蚕的蚕丝蛋白基因蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基因芽孢杆菌的抗虫基因 D.菜豆储藏蛋白基因菜豆储藏蛋白基因4.1976年年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌基因转移到大肠杆菌,并获得了表达并获得了表达,此文中的表达是指该基此文中的表达是指该基因在大肠杆菌因在大肠杆菌 ( )A.能进行能进行DNA复制复制B.能传递给细菌后代能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素能合成人的生长素3.基因工程是在基因工程是在DNA分子水平上进行设计施分子水平上进行设计施工的

11、工的,在基因操作的基本步骤中在基因操作的基本步骤中,不进行减基不进行减基互补配对的步骤是互补配对的步骤是 ( )A.人工合成目的基因人工合成目的基因B.目的基因与载体结合目的基因与载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达基因工程同步测验一、选择题一、选择题(每项只有一个正确答案每项只有一个正确答案)1下列有关限制性核酸内切酶的说法，正确的是下列有关限制性核酸内切酶的说法，正确的是A限制酶主要是从真核生物中分离出来的限制酶主要是从真核生物中分离出来的B限制酶的识别序列只能由限制酶的识别序列只能由6个核苷酸组成个核苷酸组成C限制酶能识别双

12、链限制酶能识别双链DNA分子的某种特定的核酸分子的某种特定的核酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开间的磷酸二酯键断开D限制酶切割产生的限制酶切割产生的DNA片段末端都为黏性末端片段末端都为黏性末端基因工程同步测验 2有关基因工程叙述正确的是有关基因工程叙述正确的是()A限制酶只在获取目的基因时才用限制酶只在获取目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的C只要目的基因进入细胞就能成功实现表达只要目的基因进入细胞就能成功实现表达D蛋白质的氨基酸排列顺序可能为合成目的基因蛋白质的氨基酸排列顺序可能为

13、合成目的基因提供线索提供线索基因工程同步测验3下图为下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚聚合酶、合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是连接酶、解旋酶作用的正确顺序是 AB C D基因工程同步测验4以下甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基以下甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是（因的两种方法，以下说法中错误的是（ ）A甲方法可建立该细菌的基因组文库甲方法可建立该细菌的基因组文库B乙方法可建立该细菌的乙方法可建立该细菌的cDNA文库文库C甲方法要以脱氧

14、核苷酸为原料甲方法要以脱氧核苷酸为原料D乙方法需要逆转录酶参与乙方法需要逆转录酶参与基因工程同步测验5目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()检测受体细胞是否有目的基因检测受体细胞是否有目的基因检测受体检测受体细胞是否有致病基因细胞是否有致病基因检测目的基因是否转检测目的基因是否转录出录出mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白检测目的基因是否翻译成蛋白质质 AB C D 基因工程同步测验7、(11分分)(

15、2012新课标全国卷新课标全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下根据基因工程的有关知识，回答下列问题：列问题：(1)限制性内切酶切割限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有分子后产生的片段，其末端类型有_和和_。(2)质粒运载体用质粒运载体用EcoR 切割后产生的片段如下：切割后产生的片段如下：AATTCGGCTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用除可用EcoR 切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是是_。(3)按其来源不同，基因工程中所使用的按

16、其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即连接酶有两类，即大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶 和和 T4DNA连接酶。连接酶。基因工程同步测验(4)反转录作用的模板是反转录作用的模板是_，产物是，产物是_。若。若要在体外获得大量反转录产物，常采用要在体外获得大量反转录产物，常采用_技术技术。(5)基因工程中除质粒外，基因工程中除质粒外，_和和_也可作为也可作为运载体。运载体。(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_。 基因工程同步测验8酵母菌的维生素

17、、蛋白质含量高，可生产食品酵母菌的维生素、蛋白质含量高，可生产食品和药品等。科学家将大麦细胞的和药品等。科学家将大麦细胞的LTP1基因植入基因植入啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌种可产生啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌种可产生LTP1蛋白，并酿出泡沫丰富的啤酒。基本的操蛋白，并酿出泡沫丰富的啤酒。基本的操作过程如下：作过程如下：基因工程同步测验(1)该技术定向改变了酵母菌的性状，这在可遗传变异的该技术定向改变了酵母菌的性状，这在可遗传变异的来源中属于来源中属于_。(2)从大麦细胞中可直接分离获得从大麦细胞中可直接分离获得LTP1基因，还可采用基因，还可采用_方法获得目的基因。本操作中为了将方法获得

18、目的基因。本操作中为了将LTP1基基因导入酵母菌细胞内，所用的载体是因导入酵母菌细胞内，所用的载体是_。(3)此操作中可以用分别含有青霉素、四环素的两种选择此操作中可以用分别含有青霉素、四环素的两种选择培养基进行筛选，则有培养基进行筛选，则有C进入的酵母菌在选择培养基上进入的酵母菌在选择培养基上的生长情况是的生长情况是_。基因工程同步测验(4)除了看啤酒泡沫丰富与否外，还可以怎样检测除了看啤酒泡沫丰富与否外，还可以怎样检测LTP1基基因在啤酒酵母菌中的表达？因在啤酒酵母菌中的表达？_。基因工程同步测验(1)该技术定向改变了酵母菌的性状，这在可遗传变异的该技术定向改变了酵母菌的性状，这在可遗传变异的来源中属于来源中属于_。(2)从大麦细胞中可直接分离获得从大麦细胞中可直接分离获得LTP1基因，还可采用基因，还可采用_方法获得目的基因。本操作中为了将方法获得目的基因。本操作中为了将LTP1基基因导入酵母菌细胞内，所用的载体是因导入酵母菌细胞内，所用的载体是_。(3)此操作中可以用分别含有青霉素、四环素的两种选择此操作中可以用分别含有青霉素、四环素的两种选择培养基进行筛选，则有培养基进行筛选，则有C