中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教案

1、中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教案授课科目: 医学分子生物学授课内容: 蛋白质组学的研究方法和进展授课对象：临床医学七年制、八年制授课时数： 4 学时授课教师：授课地点：湘雅医学院新教学区授课时间：授课教材：医学分子生物学（ 21 世纪高等院校教材） ，胡维新主编，北京：科学出版社， 2007 年 2 月，第一版；医学分子生物学（卫生部8 年制规划教材） ，冯作化主编，北京： 人民卫生出版社，2005，第一版第九章 蛋白质组学的研究方法和进展一目的要求掌握： 蛋白质组学和功能蛋白质组学的概念； 常用蛋白质组学研究基本技术的原理及优缺点。熟悉： 通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴

2、定的实验路线； 酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质的实验流程。了解：蛋白质组的发展史；蛋白质组学在疾病研究中的应用。2 讲授重点： 蛋白质组学及功能蛋白质组学的概念； 常用蛋白质组学研究基本技术的原理及优缺点； 通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线；酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质的实验流程。3 讲授难点 ： 通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线； 酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质的实验流程。六、讲授内容第九章 蛋白质组学的研究方法和进展一目的要求掌握： 蛋白质组学和功能蛋白质组学的概念； 常用蛋白质组学研究基本技术的原理及优缺点。熟悉： 通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进

3、行鉴定的实验路线； 酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质的实验流程。了解：蛋白质组的发展史；蛋白质组学在疾病研究中的应用。2 讲授重点： 蛋白质组学及功能蛋白质组学的概念； 常用蛋白质组学研究基本技术的原理及优缺点； 通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线；酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质的实验流程。3 讲授难点 ： 通过质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线； 酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白质的实验流程。四、教学方法： 多媒体教学五、教具： 多媒体课件六、讲授内容（同八年制）人类基因组序列（human genome project, HGP揭示基因组的精细结构，显示了基因数量有限

4、性和基因结构的相对稳定性， 与生命现象的复杂性和多变性之间存在着巨大反差。促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。基因组学在基因活性和疾病的相关性方面为人类提供了有力根据 , 但是基因的表达方式错综复杂， 同样的一个基因在不同条件、 不同时期可能会起到完全不同的作用。 因此研究生命现象， 阐释生命活动的规律， 只了解基因组的结构是不够的， 还须对生命活动的直接执行者蛋白质进行更深入的探讨。 事实上对蛋白质的数量、 结构、 性质、 相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。以“蛋白质组” （proteome）为研究对象的生命科学新时代已经到来。第一节 蛋白质组

5、学的概念及其发展史一、蛋白质组学的概念蛋白质组是澳大利亚学者Williams 和 Wilkins 于 1994 年首先提出 , 源于蛋白质（protein）与基因组（genome两个词的杂合，指“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质” 。是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同，即使是同一细胞， 在不同的发育阶段、 不同的生理条件甚至不同的环境影响下， 其蛋白质的存在状态也不相同。 因此， 蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化着的整体。 而蛋白质组学（proteomics）是指应用各种技术手段来研究蛋白质组

6、的一门新兴科学， 其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、 表达水平与修饰状态， 了解蛋白质之间的相互作用与联系， 揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。研究内容主要包括：了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的； 描绘蛋白质的精确三维结构， 揭示其结构上的关键部位 与药物结合并且决定其活性的部位。 蛋白质组概念的提出标志着生命科学的一个崭新时代 蛋白质组时代已经开始， 它是继基因组研究之后的又一 “大学科 ” 。 即以蛋白质组为研究对象， 在蛋白质多肽谱和基因产物图谱技术的基础上发展起来的一门科学， 是通过对基因表达产物 蛋白

7、质进行整体、动态、定量水平上的研究来阐述环境、疾病、药物等对细胞代谢的影响，并分析其主要作用机理、解释基因表达调节的主要方式。要对 “全部蛋白质” 进行研究是非常困难的，功能蛋白质组学的提出解决了这一难题， 其研究对象是功能蛋白质组， 即细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质， 它是介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学研究之间的层次， 并把目标定位在蛋白质群体上， 这一群体可大可小， 从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体， 以便把多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。功能蛋白质组学从理论和技术上使以 “全部蛋白

8、质” 为研究对象的蛋白质组学更具体化，更易于从时、空、量效方面动态、整体、深入地研究生理状态下同一组织细胞在不同发育阶段或同一组织细胞在不同个体间或同一基因组在不同组织细胞间， 以及病理情况下同一疾病的不同发展阶段的蛋白质表达模式和功能模式的变化，揭示一些重要的生命现象和一些重大疾病的发生发展规律。二、蛋白质组学的产生与发展20 世纪中期以来，随着DNA 双螺旋结构的提出和蛋白质空间结构的 X 射线解析，开始了分子生物学时代，对遗传信息载体DNA 和生命功能的主要体现者蛋白质的研究，成为生命科学研究的主要内容。90 年代初期，美国生物学家提出并实施了人类基因组计划， 经过各国科学家多年的努力，

9、 人类基因组计划取得了巨大成绩，一些低等生物的 DNA 序列已被阐明，人类DNA 序列的框架图已经测定，迄今已测定的表达序列标签(EST)几乎覆盖了人类所有基因。在这样的形势下， 生命科学已进入了后基因组时代。 在后基因组时代， 生物学研究的重点已从揭示生命所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。 这种转向的第一个标志就是产生了一门称为功能基因组学的新科学。 功能基因组学的主要任务是解析和综合大量的遗传信息， 阐明基因遗传信息与人类生命活动之间的联系。基因的功能是通过其产物 mRNA 和蛋白质来体现的。近年来利用基因表达系列分析( serial analysis of gene exp

10、ressio，n SAGE ) 、微阵列( microarray) 和DNA芯片(chip)等新技术研究mRNA水平上的基因活动规律取得了较大进 展。但 mRNA 水平的基因表达状况并不能完全代表蛋白质水平的状况， mRNA 与蛋白质间的相关系数仅为0.40.5,蛋白质才是生命功能的主要执行者，它存 在着翻译后的加工修饰、 转移定位、 构象变化、 蛋白质与蛋白质及蛋白质与其它生物大分子相互作用等自身特点， 难以从 DNA 和 mRNA 水平得到解答， 从而促使人们从组织或细胞内整体蛋白质的组成、 表达和功能模式去研究生命活动的基 本规律。 自 “蛋白质组 ” 概念提出并开始从整体蛋白质水平研究

11、生命现象以来， 蛋白质组研究在国际上进展十分迅速。 不论是基础理论， 还是技术方法， 都在不断地进步和完善。 许多种细胞的蛋白质组数据库已经建立， 相应的国际互联网站也层出不穷， 众多的制药厂和公司在巨大财力的支持和商业利益的诱惑下纷纷加入蛋白质组研究领域，蛋白质组研究的文章每年成倍增长。 1996 年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心( Australia Proteome Analysis Facility， APAF) ，得到了政府部门的大力支持。 同年丹麦、 加拿大也先后成立了国家蛋白质组研究中心，随后美国、丹麦、瑞士、瑞典、英国、法国、意大利、日本和德国等也加入了蛋白质组研究

12、行列。国际著名学府如哈佛、斯坦福、耶鲁、密西根、华盛顿大学、 欧洲分子生物学实验室、 巴士德研究所、 瑞士联邦工业学院均挤身此类研究。如美国国立癌症研究院（NCI）投资1 000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢月中瘤的蛋白质组数据库。 NCI 和 FDA 共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。独立完成人类基因组测序的 Celera 公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、 细胞和体液中的蛋白质及其异构体， 构建新一代的蛋白质表达数据库的工作， 以帮助研究者更深入了解细胞生理和病理过程

13、，并为药物的开发选择靶分子。 1997 年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议，预测 21 世纪生命科学的重心将从基因组学转移到蛋白质组学，为生命科学和医药学领域的研究带来了新的生机。 1998 年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议，参加者大都来自各大药厂和公司。 1999 年 1 月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议。 1999 年 5 月在日本召开的国际电泳会议上，约三分之一的文章与蛋白质组有关。我国也于 1998 年启动了蛋白质组学研究。1998 年在中国科学院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会， 并在此基础上， 提出了功能蛋白质组学的研究战略。 科技部已将疾病蛋白

14、质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展，并且于 2003 成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO）。 并分别于 2003年 9月、 2004年 8 月以及 2005年 8 月召开了中国蛋白质组学首届、 第二届及第三届学术大会， 于 2004年 10 月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。因此，蛋白质科学及技术已经成为 21 世纪生命科学与生物技术的重要战略前沿， 是生命科学突破与生物技术创新的必由之路，并且成为生命科学与生物技术引领自然科学与技术的龙

15、头。第二节 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组研究比基因组研究更复杂和困难，一方面，蛋白质的数目大大超过基因的数目。人基因组有2.54.0万个编码基因，而其表达的蛋白质可达十几万或更多；另一方面，基因是相对静态的，一种生物仅有一个基因组，而蛋白质是动态的，即随时间和空间而变化，同时还有着复杂的翻译后修饰。组成蛋白质的氨基酸有 20种，加上修饰的氨基酸则更多，而DNA 仅 4 种核苷酸组成。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。 最初的蛋白质组学主要是研究蛋白质组的组成成分，即蛋白质组表达模式 ( expression profile)

16、 。 蛋白质组表达模式研究的支撑技术主要有双向凝胶电泳和以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学。随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围不断扩展，蛋白质组功能模式的研究不断深入。蛋白质翻译后修饰和蛋白质 -蛋白质相互作用的研究已成为蛋白质组学的重要部分。一、蛋白质组表达模式的研究方法(一)蛋白质组研究中的样品制备通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 也可以进行样品预分级， 即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分， 分别进行蛋白质组研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级， 如专门分离出细胞核、 线粒体或高尔基体等细胞器的

17、蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。对临床组织样本进行研究， 寻找疾病标记， 是蛋白质组研究的重要方向之一。但临床样本都是各种细胞或组织混杂， 而且状态不一。 如肿瘤组织中， 发生癌变的往往是上皮类细胞， 而这类细胞在肿瘤中总是与血管、 基质细胞等混杂。 所以，常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较， 实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较。 最近在组织水平上的蛋白质组样品制备方面已有新的进展， 如采用激光捕获显微切割(laser capture microdissection， LCM) 方法可直接在显微镜下

18、从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。(二)蛋白质组研究中的样品分离利 用 蛋 白 质的 等 电 点 和分 子量 通过 双 向凝 胶 电 泳 (two-dimensional electrophoresis， 2-DE) 的方法将各种蛋白质区分开来是最主要的基于胶的蛋白质组学分离技术。双向凝胶电泳(2-DE)技术于1975年首先由O Farrell等创立,其原理是第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦 (IEF), 再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。第一向的IEF电泳，经 历了从最初的载体两性电解质pH梯度等电聚焦电泳到80年代固相pH梯度等电聚焦

19、电泳(immobilized pH gradient:, IPG)的发展过程。尽管传统的O'Farrell系统双向电泳有较高的分辨率，曾报道可以分离到约 1 000 多种蛋白质，但这种系统仍存在不少问题，如重复性，特别是第一向因阴极漂移而丢失碱性蛋白质，载体两性电解质pH 梯度不稳定，受电场和时间影响大，脲在低温下容易在毛细管中析出影响聚合及蛋白质分离等。 1982 年由 Bjellgvist 等发展并完善了固相 pH梯度等电聚焦技术，G?rg(1997)等成功地将之应用于双向电泳的第一向分离，从而克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的 pH 梯度

20、。由于可以建立很窄的 pH 范围(如 0.05 U/cm) ，对特别感兴趣的区域可在较窄的 pH 范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率及重复性。第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10100 kD 分子量的蛋白质。目前在一张双向电泳图谱上已可以分离到近万个蛋白质点， 并且该方法具有高灵敏度和高分辨率、 便于计算机进行图像分析处理、 可很好地与质谱分析匹配等优点， 因而这仍是目前分离蛋白质组分的最好方法， 故而已成为蛋白质组学研究不可缺少的核心技术。 但随着蛋白质组学研究工作的深入，常规的 2-DE 已显出其本身固有的局限性，因此对2-DE 技术也仍在不断完善和

21、改进之中，或者探索新的途径和思路以补充目前所使用的常规2-DE 技术，如Pharmacia公司推出了 2DE-MS自动化系统以及大通量的2-DE技术，在第二向电泳中发展了 6-12 块胶同时电泳的 Ettan 系统， 从而加快电泳速度和电泳的重复性，并推出了自动取点、酶解，以使2-DE 胶上所有样品的酶解和转移能平行化进行。前面已提到 2-DE 技术由于其高分辨率而得到广泛应用，但其有难以克服的缺点，如极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。而且此技术路线采用的胶内酶解过程也费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。为弥补双向凝胶电泳技术的缺

22、陷，促进蛋白质组学研究，目前发展了许多新型高分辨率、高通量、高峰容量的分离分析的非凝胶技术，如液相色谱法( liquid chromatography， LC ) 、毛细管电泳技术(capillary electrophoresis CE)等得到发展并在蛋白质组学研究中广泛应用，这些非凝胶技术的应用简化了蛋白质组研究步骤，又可与质谱联用实现自动化，是2-DE 技术路线的有效补充。 其中液质联用技术( LC-MS/MS )是近几年来发展迅速的新方法。蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE 的分离，然后进入 MS 系统获得肽段分子量，再通过串联 MS 技术，得到部分序列信息，最后通过计算

23、机联 网 查询 、 鉴 定蛋 白 质 。 Opiteck 等首次报 道多 维色谱技术( LC/LC-MS/MS ) ，该技术根据蛋白质的物理性质，即带电性及疏水性不同，用MS 分离多肽复合物。 Link 等利用蛋白质复合物直接分析( DALPC )方法对酵母 80S 核糖体的蛋白质进行分离鉴定， 其含有的 78 个蛋白质中的 71 个得到准确分离和鉴定，而在相同条件下，2-DE只得到了 56个蛋白质。Washburn等在多维 LC-MS/MS 的基础上又应用一种多维蛋白质鉴定技术(multidimensional proteinidentfication technology)成功分离和鉴定出

24、酵母的 1484种蛋白质，特别包括了一些在 2-DE 胶中难以获得的低丰度蛋白质。 但目前多维LC-MS/MS 技术主要作为2-DE-MS 技术的补充， 尚不能取代2-DE 在分离蛋白质中的核心地位。 进一步研究和完善 2-DE 技术，对蛋白质组学的研究仍具有重要战略意义。(三)蛋白质组研究中的样品分析鉴定对分离的蛋白质进行鉴定是蛋白质组学研究的又一重要内容，常用的鉴定技术有蛋白质微量测序、氨基酸组成分析等，但这些方法费时、费力、不易实现高通量分析。一种新的蛋白质鉴定技术 质谱( MS )法受到了人们的重视和应用， 它是目前蛋白质组研究中发展最快， 也最具活力和潜力的技术。 其基本原理是样品分

25、子离子化后，根据离子间质荷比(m/z)的差异来分离并确定样品的分子量。质谱在20 世纪初就已经产生，多用于无机物或小分子有机物的鉴定，直到 80 年代末随着 “软电离 ”技术的出现而进入生物大分子(如蛋白质)的鉴定领域。 所谓 “软电离 ”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性， 不会形成碎片离子。软电离质谱用于大分子的鉴定，主要有以下特点：灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、 既可定性又可定量、 并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。目前用于蛋白质鉴定的质谱主要有两种：电喷雾质谱( electrospray ionization mass spectrometr，y ES

26、I-MS ) 和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱( matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS ) 。 而以此为基础鉴定和注释蛋白质主要通过两种路线，一种是通过肽质谱指纹图( peptide mass fingerprinting， PMF )和数据库搜寻匹配的路线， 进行这种分析的质谱仪首选是MALDI-TOF 质谱仪， 另一种是通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配的路线，适合于进行这种分析的仪器主要是电喷雾串联质谱仪。通过

27、质谱对双向凝胶上的蛋白质点进行鉴定的实验路线蛋白质组研究中双向电泳技术（2-DE）仍然是分离蛋白质的主导技术，对2-DE 胶上蛋白质点的鉴定， 目前普遍认为 MALDI-TOF 质谱仪进行PMF 分析是合适的第一步。而MALDI-TOF 质谱仪由于其灵敏度高（可达fmol ） ，分析速度快， 谱图简单易于解析以及受缓冲液、 盐份的干扰小等诸多优点， 非常适合于进行 PMF 分析。对于那些数据库比较完善的蛋白质组样品，在较好的仪器分析状态下， 2-DE 胶上的蛋白质点通过PMF 方法鉴定的成功率可达50以上。目前很多厂家都在MALDI-TOF 质谱仪上配有自动数据搜寻分析软件， 不仅使仪器能直接

28、给出蛋白质鉴定的结果而且使分析的通量大大增加， 一台仪器一天之内分析数百个蛋白质点已不是很困难的事。然而单靠 PMF 路线来鉴定蛋白质并非总能获得成功，经常有获得的肽质谱指纹图在数据库中得不到可靠的匹配的情况。其可能的原因有（ 1）由于样品量太少， PMF 图的信噪比太低， 因而输入库中搜寻的数据质量不好；（ 2） 2-DE 胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获得的 PMF 图实际上是两个以上蛋白质PMF 图的混合图；（ 3）操作中角蛋白或其他蛋白质的污染；（ 4）该蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载； （ 5）所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多；（ 6） 所分析的蛋

29、白质是一个数据库中没有的未知的新蛋白质；（ 7）有些生物材料的蛋白质数据库规模太小。因而在上述情况下，为了要对 PMF 方法未能鉴定的蛋白质进行鉴定，可通过其他质谱技术获得该蛋白质一段或数段多肽的串联质谱信息或序列标签（sequence tag并将其输入数据库中进行搜寻来鉴定该蛋白质。 当前进行这一工作的质谱仪多用电喷雾串行质谱仪。尤其普遍的是ESI-离子肼和 ESI 三级四级杆飞行时间质谱仪，采用 MALDI-TOF 质谱仪的源后裂解功能（PSD） ，也能获得多肽片段离子的信息并推导出序列，但成功率一般低于ESI-MS/MS 。近年研究中发展起来的基质辅助激光解吸附电离 串行飞行时间（ MA

30、LDI-TOF/TOF ） 质谱技术能更进一步提高蛋白质序列标签测定的通量和准确性。与此同时，仪器的自动化和相关实验的整合使通过质谱鉴定的技术更加高通量化。但要精确鉴定某一蛋白质通常还得联合几种鉴定技术。最近，国外建立了一种将 MALDI-MS 技术直接应用于组织切片或印片的方法，即组织切片或印片原位质谱分析技术，取得了较满意的结果。当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳质谱技术， 即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离， 然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标。 一般的质谱技术难以将三者合一， 而最近发展的新型质谱如两级飞行时间串联质谱（ M

31、ALDI-TOF/TOF ） 、傅里叶转换回旋共振质谱（ FTMS ）使蛋白质鉴定的灵敏性、 可靠性和通量进一步提高， 从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定。另外，表面增强激光解吸/ 电离飞行时间质谱（ SELDI-TOF-MS ）技术在临床蛋白质组学研究领域具有独特的优势， 该技术应用基因芯片的设计理念， 把层析、 质谱等技术合理应用于蛋白芯片的检测， 它不需进行蛋白质的双向电泳， 能快速、简便地鉴定少量生物样本（组织和细胞抽提物、血液、尿液、细胞培养上清等）中差异表达的蛋白质。该技术在寻找肿瘤标志物方面已展现广阔的前景，如基于 SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片分析的卵巢癌、乳腺癌等肿瘤的

32、血清诊断模式已建立。（四）蛋白质组学研究的生物信息学生物信息学是随着人类基因组计划、计算机技术、网络技术的发展而诞生的一门新兴学科， 是蛋白质组学的一个重要的技术平台。 生物信息学研究生物信息的采集、加工、分析、存储、传播等各个方面，它通过综合应用数学、计算机科学、 工程科学以及生物学的技术来分析大量而复杂的生物学数据而揭示生物学的奥秘。 生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分， 其在蛋白质组学中的研究有两个重要应用： 一是构建和分析双向凝胶电泳图谱， 二是数据库的搜索与构建。蛋 白质 组数 据库 是 蛋白 质 组 研究水 平的标志和 基础。 瑞士的SWISS-PROT 拥有目前世界上

33、最大，种类最多的蛋白质组数据库。丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组数据库。目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST数据库。NRDB由SWISS-PROT和GENPETP等几个数据库组成。 dbEST 是由美国国家生物技术信息中心（ National Centre for BiotechnologyInformation ， NCBI ) 和欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute，EBI ）共同编辑的核酸数据库，包括许多生物体的表达序列标签（ expressedsequence tags EST）。用肽序列标签（PST）或部分序列

34、信息最适合查寻dbEST数据库。最近有报道强调用蛋白质质谱分析数据查寻EST 数据库以鉴定研究者最感兴趣的未知蛋白质的重要性，表明人类EST 数据库能满足用质谱数据快速识别哺乳动物多蛋白质复合物的要求。 生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件； 特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。随着基因组学的迅速推进， 会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。 另外， 对肽序列标记的从头

35、测序软件也十分引人注目。（五）定量蛋白质组学研究随着蛋白质组学研究的深入发展，人们已不再满足对一个混合体系中的蛋白质进行简单的定性分析，要求更加准确的定量分析。为此，有人提出了 “定量蛋白质组学 ”的概念。定量蛋白质组学，就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。 这一概念的提出， 标志着蛋白质组学研究已从对蛋白质的简单定性向精确定量方向发展， 并且成为当前蛋白质组研究的一个热点。 蛋白质组研究和基因组研究相比最大的不同和难点之一是定量， 而蛋白质表达量的差异又是影响生物功能的重要因素。 蛋白质组定量技术现在还处于起步阶段， 也面临很多难点： 首先， 对

36、低丰度蛋白质检测的困难显然阻碍对这些蛋白质的定量。 其次， 当蛋白质表达量差异很小， 如在50%以下时，精确定量成为瓶颈。 另外， 生物体系中蛋白质表达瞬时变化的捕捉是样品制备中需要关注的问题， 总之， 蛋白质组定量技术的研究和应用还任重道远。 目前定量蛋白质组研究策略主要有： 基于双向凝胶电泳的定量蛋白质组研究策略和基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略等。1基于双向凝胶电泳的定量蛋白质组研究策略双向凝胶电泳（ 2-DE） 作为蛋白质组学的主要技术伴随着蛋白质组学的发展而发展，是目前唯一能分离展示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的一种方法，具有高通量、重复性好、分辨率极高、敏感性较高等优点，能同时

37、分离和定量数千种甚至上万种蛋白。虽然它有许多不尽如人意的地方 , 但依然是蛋白质组研究的一个重要手段， 在蛋白质分离和定量分析中显示其独特的魅力。 在传统的双向凝胶电泳上比较两种存在差异表达的蛋白质组样品时， 要将其总蛋白分别展现在不同的凝胶上。由于双向凝胶电泳重复性的问题，每种样品通常需做多次电泳，以获得图像的电子“平均值” ，从而使二者间的比较更有把握。同时，考马斯亮蓝与银染蛋白质点定量上线性动态范围较窄， 为蛋白质点的精确定量比较带来限制。荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE ）是在传统双向凝胶电泳基础上发展起来的定量分析凝胶蛋白质点的新方法， 其优点是可以在同一块凝胶上比较两种不同

38、来源或不同处理的蛋白质组表达， 能比较精确地在较宽的动态范围内对研究者感兴趣的蛋白质进行定量， 因此成为一种有较好应用前景的定量蛋白质组学研究方法。 该方法首先将待比较的几个样品的总蛋白分别用两种不同的荧光标记试剂（ Cy2、 Cy3 或 Cy5 ）进行标记，然后将不同荧光染料标记的几种待比较蛋白质等量混合，上样进行双向电泳， 2-DE 凝胶在成像仪上用不同的波长激发，分别将样品的荧光图谱成像，用 2D 分析软件进行定量分析，对差异的蛋白质点用MALDI-TOF-MS 或 ESI-MS 进行鉴定。荧光差异显示双向电泳（亦称荧光差示双向电泳） 与传统的双向凝胶电泳最大的差别在于前者采用了荧光试剂

39、来标记蛋白质并通过荧光成像以获取电泳图像。 这种方法的优点是可以在同一块凝胶上比较两种不同来源或不同处理样本的蛋白质表达谱， 能在较宽的动态范围内精确地对感兴趣的蛋白质进行定量。2基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略由于不同蛋白质和多肽在质谱仪中离子化能力不同，质谱仪检测得到的信号对来自单一样品的蛋白质并不具有定量功能， 所以从质谱图中不能得到量的信息。 但是对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽， 可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积） 得到待比较蛋白质的相对量。 根据这一原理发展了基于生物质谱的定量蛋白质组学分析方法。 Oda 和 Gygi 等人最先利用此原理，用一种质量标签标记一种状态下的蛋白

40、质， 然后与另一种状态下没有标记的蛋白质混合起来， 进行质谱分析， 通过比较某蛋白质没有标记的峰和标记后峰的强弱， 就得到这种蛋白质在两种状态下表达量的变化。 这里经常用到的内部标准就是稳定同位素 （如2D、 13C、 18O 和 15N ）标记的小分子，这些小分子必须满足一定的条件：不同样品来源的肽段标记后化学性质是相同的； 若与高效液相色谱联用， 标记后肽段的保留时间要尽可能相同。二、蛋白质组功能模式的研究方法蛋白质功能模式的研究是蛋白质组研究的最终目标。其主要研究目标是要揭示蛋白质组成员间的相互作用、 相互协调的关系， 并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系， 以及基因结构与蛋白质结构功

41、能的关系。蛋白质翻译后修饰和蛋白质 -蛋白质相互作用的研究已成为蛋白质组学的重要部分。 近年来， 随着蛋白质组学研究技术的发展， 发展了许多有效的功能蛋白质组研究方法， 如酵母双杂交系统、 噬菌体展示、 生物传感芯片质谱、 基因工程和蛋白质工程中的突变表达分析、核磁共振成像、 X 线晶体衍射分析、蛋白质芯片技术等。（一）蛋白质翻译后修饰的研究随着后基因组时代的到来和蛋白质组学技术的迅速发展，对生物体器官、组织或细胞的蛋白质的翻译后修饰研究已经成为蛋白质组学的一项重要任务。 蛋白质在翻译中或翻译后会在氨基酸链上共价结合各种非肽类基团， 形成翻译后修饰，这些修饰能影响蛋白质的物理、化学性质、折叠状

42、态、构象分布、稳定性以及活性， 而且翻译后修饰本身可作为一个附加功能基团发挥作用。 生物体能迅速对体内环境变化和外界环境刺激产生应答反应， 这些反应过程靠复杂的调控机制调节， 其中大多数调控机制是由蛋白质的构象变化所介导的。 而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构上发生的各种共价修饰来实现的。蛋白质翻译后修饰包括:糖基化、二硫键的配对、甲基化、乙酰化、羧基化、焦谷氨酸化、蛋白质降解、S-硝酸化以及ADP核糖基化等二十多种，是蛋白质行使正常生理功能所必需的。有些修饰基团只出现在蛋白的 N 端，与氨基酸种类无关； 有些却只出现在某几个氨基酸残基上， 与氨基酸位置无关； 还有些修饰

43、现象既与氨基酸种类有关， 又与其位置有关。 这些修饰基团会影响蛋白质的相对分子质量和等电点， 使其在双向电泳胶上偏离其理论位置。 蛋白质的翻译后修饰与其活性及功能状态有关， 也与蛋白质所在细胞的种类和生命周期相关。 完全理解特定蛋白质结构与功能的关系需要掌握多方面的信息， 而不仅仅是它的氨基酸序列， 翻译后修饰也是非常重要的信息。 但是目前蛋白质翻译后修饰的研究面临着以下困难： 其一、 被翻译后修饰的蛋白质经常只是很少的拷贝数， 因此修饰肽的检测需要高灵敏度的方法； 第二、 蛋白质翻译后修饰要求在确定其修饰位点和修饰数目的同时进行定量分析； 第三、 蛋白质多肽之间的键经常是脆弱的， 很难找到一

44、定的条件使得在修饰状态下进行处理和电离； 第四、 已经有超过400 种蛋白质翻译后修饰被发现，且所有可能修饰蛋白质序列的测定工作是巨大的。所以，尽管二维凝胶电泳和质谱等蛋白质组技术不断完善， 但是从整体上了解蛋白质的翻译后修饰正面临着巨大的挑战。随着质谱技术的灵敏度和准确度的大大提高，质谱已经成为分析蛋白质翻译后修饰的中坚力量， 目前蛋白质翻译后的修饰的解析主要采用电喷雾（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI ）两种质谱技术。蛋白质的糖基化和磷酸化修饰在生命活动中具有重要的调控作用， 是最常见、 最重要的共价修饰方式，是目前蛋白质组中翻译后修饰研究的热点。（二）蛋白质相互作用研究技术生命

45、的基本过程就是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用的结果。越来越多的研究显示： 细胞中绝大多数的酶和调控过程是以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现的。 另外， 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应等都是蛋白质相互识别和相互作用的结果。 由于生命活动的过程与蛋白质的相互作用密不可分， 因此， 蛋白质相互作用的研究成为了功能蛋白质组学的重要内容， 现就蛋白质相互作用研究的主要方法简介如下。1酵母双杂交系统细胞中含有多种蛋白质，其中包括许多蛋白质体系，如多酶复合体、多肽激素与受体， 酶和底物蛋白等， 通过直接分离的方法获得某种细胞蛋白并对其进行研究是一个非常棘手的问题。 但是我们知道， 任何细胞蛋

46、白质都是由染色体上的相应基因转录出 mRNA 并进行翻译的产物，细胞 cDNA 文库在理论上含有编码细胞全部蛋白质的基因，因此，将细胞cDNA 文库插入适当的融合表达载体，即可获得一个细胞蛋白质文库， 通过对蛋白质编码基因的遗传操作便可间接研究蛋白质之间的相互作用，确证和筛选已知蛋白质的完整配体并阐明其生物学特性。1989年Field和Song等人在酵母细胞中设计了一种巧妙的、新的分析蛋白质相互作用的方法 酵母双杂交系统（ yeast two-hybrid system） 。酵母双杂交系统是以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。 真核细胞转录激活因子的结构基本相似， 由一个 DNA

47、结合结构域 （DNA-binding domain ， BD） 和一个转录激活结构域（transcriptional activating domain， AD） 组成，这两个区域对于转录激活因子的功能均是不可缺少的。 酵母蛋白 GAL4 就是一个典型的转录激活因子，能转录活化酵母半乳糖苷酶（galactosidase） GAL1 和 GAL10 基因。 GAL4由881个氨基酸组成，N端1 147位氨基酸含细胞核定位序列（NLS）和与酵母 GAL1 基因启动子上游激活序列（upstream activation sequence of GAL1, UASg）结 合的结构域。UASg由4个17

48、 bp位点组成，每个17 bp位点均能与GAL4 BD区 结合。 GAL4 C 端 768 881 位氨基酸含GAL1 转录激活结构域。这两个结构域相互独立但功能上又互相依赖， 它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性。根据GAL4 的这一特点,研究者分别构建了含GAL4 BD 和AD 的两个酵母融合蛋白表达载体， 并经过遗传学操作建立了含特殊基因型、 适 用于双杂交体分析的酵母菌株。这些菌株含UASG/GAL1/ 报道基因（LacZ、 His3或Leu2）,缺失了内源性编码GAL4蛋白及其抑制蛋白GAL80的基因，突变了编 码色氨酸（Trp）,亮氨酸（Leu）和组氨酸（Hi

49、s）的基因，这样酵母本身不能对GAL1进行转录调控，在缺乏Trp 、 Leu 和 His 的培养中不能生长， Leu、 Trp 和 His 成为选择转化酵母菌株的标志。实验中，将靶蛋白 X 基因克隆在酵母BD 表达载体， 能在酵母菌中表达由 GAL4 BD 区和靶蛋白 X 组成的融合蛋白， 将待筛选蛋白 Y 基因 （或 cDNA 文库基因） 插入至 AD 表达载体， 它能表达由 GAL4 AD 区 和蛋白 Y 组成的融合蛋白，然后将两个表达融合蛋白的载体转入含报道基因的酵母菌株，如靶蛋白 X 和待筛选蛋白 Y 能相互结合，则 GAL4 的 BD 和 AD 区重建为具有功能的转录激活因子，活化报

50、道基因UASG/GAL1/LacZ 转录，阳性菌落显示明显的Galactosidase活性，出现兰色菌斑，从而达到从cDNA文库中 随机筛选靶蛋白配体的目的 （图 9-2） 。 除颜色筛选外， 营养缺陷型筛选也应用较多，通过在缺乏相应氨基酸（如Leu、 His ）的培养基菌落生长与否来判断报道基因UASG/GAL1/His3或Leu2是否表达。酵母双杂交系统筛选相互作用蛋白流程图酵母双杂交系统研究蛋白质相互作用具有如下主要特点和优势： 不仅 能筛选（识别）已知蛋白质的配体，而且能快速获得蛋白质的编码基因，使蛋白质表现型和基因型之间完美的联系起来；可以筛选cDNA文库中编码的、与已知蛋白质作用的

51、成分；在细胞内研究蛋白质间相互作用，蛋白质可保持天然构象， 能真实反应体内蛋白质间相互作用情况， 且可免受实验操作的影响； 该方法是通过对编码蛋白质的基因进行操作而间接研究蛋白质间的相互作用，因此省去了分离靶蛋白这个非常棘手的问题；该方法敏感性高，能检测到较弱的一过性的蛋白质之间相互作用。正由于此项技术具有上述优点，使之广泛用到分析蛋白之间的相互作用，至今，利用这一系统已证实和筛选出了大量具有相互作用的蛋白质，而且发现了许多新基因。近年来，在酵母双杂交系统的基础上，又出现了酵母三杂交系统（yeast three-hybrid system）和酵母反向双 杂交系统（yeast reverse t

52、wo-hybrid system）。酵母三杂交系统和反向双杂交系统作为双杂交系统的有益补充， 在研究蛋白质相互作用中发挥着日益重要的作用。酵母三杂交系统主要用于研究多蛋白质复合体之间的相互作用，反向双杂交系统可发现蛋白质间的结合解离，主要用于从大量突变体中直接筛选出导致蛋白质间相互作用减弱的突变位点，以及发现可导致已知蛋白质间特异相互作用发生解离的肽类或其它小分子物质。酵母双杂交系统研究蛋白质相互作用也存在如下缺点：许多靶蛋白与GAL4 BD 融合后， 具有转录激活报道基因的功能， 从而导致假阳性结果； 如果蛋白质需要通过翻译后修饰才能发生相互作用，而这种特定的翻译后修饰在酵母细胞中又不发生，

53、则导致假阴性结果；它只能研究在核内表达的蛋白质的相互作用，而且融合蛋白质的构建可能会影响到蛋白质本身的活性或折叠状态，这些因素亦可导致假阴性结果。2噬菌体表面显示技术噬菌体显示技术（ phage display ）是一种噬菌体表面表达筛选技术，该技术的建立基于下列三个基本因素：在噬菌体pin和pu衣壳蛋白的N端插入外源基因（待筛基因）编码的蛋白，形成的融合蛋白，表达在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象也能被相应的抗体或受体识别； 利用固定于固相支持物 （如酶标板） 的筛选分子 （抗体或受体） ， 采用适当的亲和筛选法（ panning） ，洗去非特异结合的噬菌体， 最终从噬菌体文库

54、中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体； 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面， 而其编码基因作为噬菌体载体（噬菌粒）基因组的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA 测序推导出来，使得表达蛋白（表型）和编码基因（基因型）之间有机地联系在一起。噬菌体显示技术应用范围非常广泛，主要应用范围包括：筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质。研究抗体或受体的结合位点；构建随机肽库、抗体库和蛋白文库； 改造和提高蛋白质、 酶和抗体的生物学和免疫学特性； 研究新型多肽药物、 疫苗和抗体； 研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学过程和新型的基因治疗导向系统等。噬菌体显示技术研究蛋白质相互作用具有如下主要优点：可在细菌外完

55、成对外源多肽、蛋白质和抗体的研究并方便地获得目的分子DNA序列。高度的选择性，每一次亲和筛选出的噬菌体感染大肠杆菌后，该噬菌体可得到 1 000倍甚至更多的扩增， 几次循环后， 可得到相互作用的序列； 可以构建大的噬菌体文库，亲和纯化可在高浓度（103噬菌体/ml）下进行；以往对生物大分子的相互作用研究需要对筛选分子结构有详细了解， 而此项技术克服了研究蛋白质相互作用的这种限制， 这也是其得以广泛运用的直接原因。 但该技术也存在着一些局限性， 包括： 多价展示中对于肽段大小的限制； 外源蛋白质在宿主细菌中有时无法正确折叠或修饰； 构建的融合蛋白有可能会影响到蛋白质本身的活性。3基于质谱的蛋白质

56、相互作用研究方法蛋白质鉴定是研究蛋白质相互作用的重要步骤，而质谱（ mass spectrometry,MS）分析技术的引入是蛋白质鉴定中最重要的技术突破，它具有高通量、灵敏、准确、自动化等特点，已逐步取代传统的 Edman 降解测序和氨基酸组成分析，成为蛋白质鉴定的核心技术， 已广泛用于二维电泳、 色谱分离的蛋白质， 以及蛋白质复合体的鉴定。 基于质谱技术研究蛋白质相互作用的基本步骤主要由三个部分组成：靶蛋白制备，蛋白质复合体的纯化，蛋白质复合体的质谱鉴定。 蛋白质复合体的纯化方法主要有传统的亲和层析和免疫共沉淀， 以及新型的串联亲和纯化（TAP）和生物传感器技术（如Biacore技术）。根据纯化蛋白质复合体的方法的不同，可将基于质谱的蛋白质相互作用研究方法分为以下几种。（ 1）亲和层析耦联质谱技术亲和层析是一种传统的纯化蛋白质复合体、研究蛋白质相互作用的方法。其基本原理是将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖） 上作为诱饵， 让含有与之相互作用的蛋白质的细胞