中低压制备色谱概况

1、drusuidrusui中低压制备色谱色谱分离的机理Stdlionary PhaseACRrK一Mobil匕 lliascL ' SXXXXXXXXXXXXXXXXXXInjectionInteraction流动相(Mobile Phase) 固定相(Stationary Phase) 样品(溶解于流动黜中的溶质)Elutionxxxxxxxxxx)oo3Akx俄国科学家M. S. TswettUSUI薄层色谱层析(TLC)薄层色谱(TLC)是化学工 作者检测、鉴定混合物组分 的一种简单、快捷而低廉的 方法，是基于混合物中各组 分与流动相和固定相作用力 存在差异使得它们保留时间 不同而

2、完成分离。比移值：Rf=L/Lo薄层色谱的主要用途： 跟踪化学反应，判断化学反应是否已进行完全； 粗略检测试剂和原料的纯度； 粗略检测产品的纯度： 为柱色谱摸索条件。薄以色谱的核心是展开剂的选择问题，选择展开剂之前, 要对各组分所有的物质有详细的了解，包括： 所含化合物的数目； 化学结构和分子量： PKa值和UV谱图； 在样品中的浓度范围和溶解度。drusui展开剂的选择碱性角 质子接受）1 :甲乙酸、乙隧甲醇、乙酹DMF、 THF 乙二醇、乙酸5： CH2c12、二氯乙烷6 ：乙酸乙酯、乙牌7 ：芳烽、芳雄8 ：三氯甲烷，水酸件角 （质子给广）偶极角（偶极作用）溶剂选择性分类三角形图drus

3、uiSnyder溶剂图斯奈德（Snyder）的溶剂选择型分类三角图，根据溶解 度数据推导出来，因此可以度量分配色谱的溶剂强度。溶剂 由于偶极性和酸碱性的不同，在流动相中对所分离的样品就 会程现出不同的分离效果，酸性溶剂库近酸性角，碱性溶剂 靠近碱性角，偶极起主要作用的溶剂则靠近偶极角。处于同组中的各个溶剂的极性参数相同，在色谱中具有相似的选 择性，而处于不同组别的溶剂，其选择性相差较大。例如：化合物在四氢吠喃（3）中分离效果差，如果要改善分离 效果，就最好从二氯甲烷（5）、甲苯（7）、三氯甲烷（8 ）中选择，而乙醛（1 ）、甲醇（2）、乙酸乙酯（6）效果 就相对较差。1:多种溶剂对待分物进行爬

4、板研究，发现在乙醉中各组分爬的高而分不 开，在丁酮中各组分爬的低而分不开，只有:氯甲烷极性适中，但是只 能分开最下面的点，上面的部分不能有效分开。2：通过增加其它溶剂降低乙醉或增强厂酮的极性，选择合适的溶剂体系 ,使极性与二氯甲烷极性相同。7:3的乙醇/正己烷体系，最上面的点和 其余组分能够有效分开，但其余各组分相互之间不能分开。9:1的丁酮/ 水体系，极性合适，但各组分仍不能分开。3：鉴于第步和第二步的分离情况，二氯甲烷体系中最下面点分离最好 ,7:3的乙醇/正己烷体系上面点分离最好，就采用它们作为溶剂体系进 行分离研究，研究后发现，这两种体系在5:5的比例混合后效果最好。最终确定采用乙醇、

5、正己烷、二氯甲烷三元体系叮以将待测样品完全分 开。溶剂强度黏度 (cp20-C)沸点（。紫外故止波长 nm水1.001.001001ST甲酹0.950.6065205乙醇().881.2079210异内醇0.822.3782205乙瞪0.650.3782190乙酸乙酯0.580.4577256四匆映喃0.570.5566212丙酮0.560.3256330二二甲烷0.420.4440233乙健0.380.2234218甲笨0.290.591112S5正己烷0.010.3369190正炭烷0.010.4198195常用溶剂硅胶类正相色谱中，混合溶剂的溶剂强度计算公式:Solvent FrontO

6、riginHexane/CH2C121:20.300.28Strength=4>1 2 * E2+drusui常用（TLC）的展开方法一般用 EA： PE（I： 16； I： 8； I： 6； 1： 2； 1： 1； 2： 1； 3： 1； I： 0）对卜在EA/PE里不溶解的化合物，可以用CH2c12代替以HKJPE,但是EA 的用量必须减半才能到达同样的Rf值。极性较大的化合物：MeOH： CH2C12 （2.5： 100； 5： :100； 10： 100）. MeOH量一般不超过10%,否则SiO2会溶解的。碱性化合物:NH4OH： MeOH： CH2C12（0.5： 5： 10

7、0； 0.5： 1（）： 100）. NH40H是浓氨水。最好先混合NH40H和MeOH,再加CH2c12。酸性化合物：AcOH： MeOH： CH2C12 （1 ： 5： 100； 1： 10： 100） 极性非常大的的化合物：H2O： AcOH： MeOH： CH2CI2（I： 2.5： 20： 100）。这个条件什都能展开！但只适合于TLC。在SiO2柱上会溶解SiO2的。drusui硅胶色谱中常用的TLC展开剂样品展开剂亲脂小分子正己烷:乙酸乙酯（9:1 ）正己烷:丙酮（97:3）酚类环己烷:乙酸乙酯（4:1）环己烷:丁酮（7:3）瘦酸类苯:甲醇:乙酎t ( 45:8:8 )脂肪酸类石

8、油醍:乙醛:乙酸（70:30:2）乙酸:乙肝（1:1 ）胺类乙醇:氢氧化胺（25%） （4:1 ）胺醛类正丁醇:乙酸:水（3:1:1 ）丙醇（34% ）:氢氧化胺（67:33）糖类苯:乙酸:甲醇（1:1:3）丙醇（34% ）:氢氧化胺（3:1 ） 乙酸乙酯:异丙醇:水（5:205）蛋白类氯仿:甲醇/丙酮（9:1 ）葩类苯/石油酸/异丙酰:丙酮（9:1 ）生物碱笨:乙醇（9:1 ）氯仿:丙酮:三乙胺（5:4:1 ） 氯仿:丙酮:正丁烷:氢氧化胺（3:3:4:1 ）drusui柱色谱层析柱色谱是薄层色谱的发展，根据薄层色谱的分离条件，可以设计出柱色谱 的分离条件。柱色谱包括色谱柱和填料等，其中色谱

9、柱按材质分为不锈钢 柱、玻璃柱、PP柱等，主要选择参数是色谱柱的内径和长度。在现代制备 色谱中，分离效果好坏很大程度上取决色谱填料的选择.正相：硅胶，或者是硅胶键合基团CN（脐基）、DIOL （二醉基）、NH2 （如基）等。反相：C18 （十八烷基）、C8 （辛烷基）、C2 （乙基）、CH （环己烷基）、PH （茉 基）都是反相固定相。氨基取代填料：碱性化合物的分离（不能用广醛/酮以及能与氨基反应的化合物）. 硅酸镁填料：纯化酸敏感性化作物和弱碱性化合物，特别是保护基团（如TMS） 氧化铝填料：碱性、中性、酸性大孔树脂：一般用于天然产物的初步分离。离交换树脂：离;交换树脂主要用亏生物碱的富集U

10、SUI选用指南U样就反制帧合碇K(反拐«基(反捐««(1F捐胡于文执(正®*性«化命(正<3反指快自0股(反相一蓝金捐反相at台餐(反相：M*反捐正相MJK(正的MaiEE中性纸化创(正®反相tt合迷破(反初)收股(正*9SLS(正”反*yW性断化你(正«J阳两子交投(正想中性a化格(正想*(正9中性质化18(正岩UM蟆(正第mK(正!)金目«副(正想USUI柱填料对选择性的影响USUI-IQO-90-BO-70-80-20-10DMM30 3S-0 30- o n is o io- 0U5- QOONorm

11、al Phase ColumnSolvents: Hexane/EtOAcAmine ColumnSolvents: Hexane/EtOAc柱填料对选择性的影响Rcicmioa umc<nMn>装柱一般分为干法装填和湿法装填，总的原则是装填结实、高度适 中、表面平整。密度：不结实影响柱效高度：15cm,长则扩散或拖尾，短柱效低表而：平整，不平样品走不平干法装填：简便，易产生气泡湿法装填：无气泡，装填时阻力大中压色i普系统所用硅胶相对粒径较细，般采用干法装填。硅胶定要填 结实、平整：一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的卜.端不再 发烫，恢复到室温后再撤去压力。反相填料采用一

12、般湿法装填，待在甲的 中超声脱气后，再装填结实平整即可。drusui上样干法：样品拌在硅胶中，铺在填料的表面。低沸点溶剂中胶的质量是 样品质量的1.2-1. 5倍，旋干后，不能看到明显的固体颗粒。湿法：将液体或溶液样品直接加在填料的表面。口对于液体样品或 粘稠状半固体样品只能采用湿法上样。干法或湿法装柱都要求尽可能薄的平铺在硅胶上，太厚会造成分离效果 差或分不开样品。drusui柱色谱上样量计算柱色谱上样量与柱填料量的最佳比值也可通过薄 层色谱实验确定。首先确定最佳上样液浓度。在薄层色谱以能够不使样品点因过我而 严重拖尼引致分离失败的最高浓度为最佳上 样液浓度。接着计算标层色谱板上的有效硅胶体

13、枳.计算公式为长X宽XR,其中长为基线 到溶剂前沿的长度，宽为样品点的最大宽度, 厚为薄层色谱板的硅胶厚度。通常硅胶填料 的平均密度为0.5g/cm3°最后由最佳点样质量和有效硅胶体积,计算出样 品质量与硅胶质量的最佳比值。例如：最佳上样体枳为0.002mL,薄足板硅胶厚 度是O.25mm,样品点最大宽度为5mm,基线到 溶剂前沿的长度为70mm.薄层色谱的有效硅胶质后为：0.025cn X 0.5cm X 7cm/0.5gcm-3=0.175g则样液体枳比硅胶项小的比值为：0.002mL/0.175g=0.05mL/g对于填料为30g的色谱柱，上样量为：0.05mMgX30g=1.

14、5mL转化为柱色谱条件时,我们将样品质量与硅胶质 量的比值保持不变色谱柱尺寸分离容易的样品： 最高10%上样量分离困难的样品： 低至1%上样量4g400 mg40 mg12g12 g120 mg25g2.5g250mg40 g4.0 g400 mg80 g8.0 g800 mg120 g12g12g330 g33 g3.3 gdrusui推荐上样量由流动相对细分行亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直 笠影响g 1分的分离度。对流动相溶剂的要求是:（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的逃择性。（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器,应注意选用检测器波长比溶剂

15、 的 紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小广截止波长的辐射通过溶剂时， 溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重-F扰组分的吸 收测量。（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求而。不纯的溶剂 会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使假止波长值增加50100nmc（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力,不利于分离。常用的低粘度溶剂 行丙酮、乙醉、乙晴等.但粘度过卜低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙悔等，它们易 在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。柱色谱压力模式常压：常压柱是效

16、率最高的，但是时间也最长。比如天然化合物的分 离，一个柱子儿个月也是有的。减压：能够减少硅胶的使用量，溶剂挥发量加大，有些比较易分解的 东西可能得不到，水泵抽气耗时且噪音大。加压：drusui柱色谱建立柱色谱的方法通常是根据薄层色谱的结果建立的。柱色谱的洗脱剂通常与薄 层色谱的展开剂采用同种溶剂，只是根据需要改变组成比例。Rfa = a/cRfb = b/cCV = 1/Rfcv是把一成分从柱中洗脱出来所需要柱体枳 的数目，和柱子的大小无关。柱体积是填料 所占柱管体积的几何体积。加快洗脱剂的流速，提高分离速度；允许在分离过程中使用颗 粒度更小的吸附剂，从而获得更高的分辨率:敏感化合物在进行长

17、时间的常压色谱分离时，其结构可能会发生变化，缩短分离时间的 最大优点在于可以避免这种变化的发生。USUIACV = CVa - CVb = 1/Rfa - 1/Rfb般来说，只有ACV大于1时，：者在柱色谱中才可以完全分离。实 际操作时.当溶剂流过个柱体积时.样品在色谱柱内移动的相对值往往 大Rf,闪lltACV往往小厂计算值，这要求我们在设计色谱条件时更应加 大ZkCV的计算值。在理想的快速色谱分离中，待分离的化合物应该在3-6 个柱体积内洗脱卜.来，并且，两个相互分开的物质，洗脱的柱体积应该在 1以上。USUI由于不同生产厂商的生产的硅胶的相对的湿度、颗粒度大小和结合剂 的不同，有时候的最

18、佳TLC分离条件并不能直接应用到快速色谱分离。在 实际作中，应该考虑这些因素的影响，建议使用同生产厂家的统规 格的固定相，流动相的租成比例应以体积比为准，和快速色谱系统的表示 方式i致。Rf和ACV关系表0.050.100.150.200.250.300.350.400.45080.550600.650.700.750.800.850.900.95O.CS0.000.1010W0.000.1513333.33O.OJ0.2015.005.001.670.000251686.002.671.000.000.3016.676.673X1670.67O.CO0.2517.147143.812.141

19、.1-40.470.C00.毛17.507.50<172.S01.500.830.360.000.4517.787.794.452.791.761.110.640.280.000.9018.009.004.673.002.001.330.060.500.22口.00.S18.188.184.853.182.161.51l.Ot0.660.400.180.000.6016.338.335.003.332.331.661.190.830.550.330.150.000.6518.469.465.133.462.461.791.320.S60.680.460.290.130.000.7D16.

20、578.575.243.572.571.901.431.070.790.570.390240.110.000.7518679.675.343.672.672.001.531.170.890.670.490.340.210.100.000.9018.759.755.423.752.752.091.61150.970.750.570.420.290.180.0G0.000.6516.628.825.493.822.822.151.661.321.04020.64a490.360250.15ao?0.000.9018.890.995.563.092.992.221.751.391.110s0.710

21、560.430320.22a 140.070.00.519.959.955.623.952.952.291.B11.451.170.950.770.620.490.380.260.200.130.050.00drusuiCartridge:FLASH 12+S (12x75 mm)Eluent:A) HexaneB) EtOAcGradient:Linear, 5%B to 100%B in 60 mL (10 CV)Flow rate:13 mL/mlnLoad:50 mg#CV:10Cartridge:FLASH 124S (12x75 mm)Eluent:A) HexaneB) EtOA

22、cGradient:Step 1 - 20%B for 60 mLStep 2 - 75%B for 30 mLFlow rate:13 mL/mlnLoad:50 mg#CV:15洗脱方式洗脱方式分为等度洗脱、台阶梯度洗脱、线性洗脱、台阶/线性洗脱等度洗脱：等度洗脱是分离中使用恒定组成的是最常用的办法，可以分离 许多类型的化合物。台阶梯度洗脱：台阶梯度洗脱适用分离复杂样品，在台阶是洗脱中，一系 列恒定组成的溶剂以不连续的台阶分段对柱淋洗，可以缩短纯化周期，减 少溶剂消耗。线性洗脱：在快速色谱纯化中，线性洗脱是最常用的，现行梯度洗脱是， 溶剂极件随时间连续变化，可以使柱分离加快，是纯化工作更简

23、单，更快 捷。台阶/线性洗脱：方法的结合可以分离最更杂的样品，洗脱方式的连用， 可提高分离度，缩短分离时间，降低最小检测量，提高分离粘度，对复: 杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。Cartridge: FLASH 12+S (12x75 mm) Eluent:Hexane/EtOAc 80:20, isocratlcFlow rate:13 mL/mlnLoad:50 mg# CV：30LISUI影响分离度的因素:KJ a及N-y是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱-a是分离闪子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因索- N是理论塔板数，描述色谱

24、峰谱带展宽的程度k、N、a对分离的影响初始增大k增大N 改变aUSUIN =理论塔板数：分离效率的量度N = 1600N = 100USUI流速(cm/min)= 2, Vo = 1000gL 理论塔板数峰宽与塔板数的关系塔板数与流速的关系drusui1-.5USUI1根正:相柱-153- 10-e3 305DJ.50940J30H3D3.202DI.J/-JJO-BD-80130'030- irn-6根柱串联叠加柱串联是一个可以显著提高分辨率的有效工具，是一个分离复杂 样品的简单技术，无需对硬件或溶剂作很大改变。每增加一个柱就可以 提高分辩率，可增加柱直到达到需要的分离效果。USUI

25、公司简介上海利穗）全自动快速制备层析系统及耗材的专业生产企业2拥有资深的化学分离专家和专业级的应用实验室3 拥有自动化/精密仪器加工的强大技术力量和经验4 致力于化学和生物领域的自动化设备/系统的设计开 发，生产以及市场推广drusui全自动快速柱层析系统Dr FlashEz PurifierdrusuiDr Flash H ：双泵系统，大收集台面全自动快速柱层析系统EZ Purifizer ：单泵系统，利用电磁阀实现梯度运行涉及领域，主要两大领域：客户对象：1、高校2、科研单位1、天然药物提取3、CR。公司（外包公司）2、合成化合物分离4、有研究室的医药公司注：CR。即介同研究组织，Cont

26、ract Research Organizationdrusui快速层析系统优点:自动在线检测 灵活配置成本更低快速制备层析系统适用于:化学合成/天然产物/生物 组分的分离提纯亲水性化合物的分离提纯 高极性天然产物分离提纯大分广的色谱分离（生物色谱,Biochromatography ） 水溶性海洋天然产物分离提纯 中草药植物液体提取物（浸出液）的活性成分分离提纯亲脂性化介物的分离提纯 手性分子的分离提纯USUI自动在线检测，灵活配置 最优的灵敏度和选择性 可使用性价比最佳的固定波K紫外检测器，在线检测用于 纯净物的收集 可使用可变的多波长紫外检测器，一个波长的检测用于纯 净物的收集，同时使用另外儿个波长的检测器进行分离纯 化的检测（最多可以使用6个波长） 可使用其他类型