中国荷斯坦牛红毛基因变异及其编码蛋白结构预测

1、中国荷斯坦牛红毛基因变异及其编码蛋白结构预测李秋玲1,李建斌1,张争锋2,王洪梅1,高运东1,侯明海1,仲跻峰1(1山东省农业科学院奶牛研究中心，济南250100;2山东省计算中心，济南250014)摘要：【目的】通过对中国荷斯坦牛MC1R基因的核音酸序列分析和蛋白结构预测，探讨中国荷斯坦牛红白花毛色形成的分子机制。【方法】采用PCR-RFLP技术对MC1R基因进行分型，利用生物信息学方法对其蛋白结构特征进行模拟分析。【结果】检测出与毛色表型相关的三种基因型，EE基因型在中国荷斯坦黑白花牛中占优势，ee基因型在中国荷斯坦红白花牛中占优势。蛋白预测结果显示，ee基因型个体的缺失突变使蛋白质翻译提

2、前终止，引发二级结构改变，导致中国荷斯坦牛红白花个体的出现。【结论】E等位基因主要与黑色毛色形成有关，e等位基因主要与红色毛色形成有关。关键词：牛；红毛；MC1R;蛋白结构Study on Red Coat Color Gene and Prediction of Protein Structure in Chinese HolsteinLI Qiu-ling1, LI Jian-bin1, ZHANG Zheng-feng2, WANG Hong-mei1, GAO Yun-dong1, HOU Ming-hai1,ZHONG Ji-feng1(1Dairy Cattle Research

3、Centre, Shandong Academy of Agricultural Science, Jinan 250100 ;2Shandong Computer Science Center,Jinan 250014)Abstract: Objective The objective of this study was to study the nucleotide sequence of MC1R gene, predict its protein structure in Chinese Holstein,and investigate the molecular mechanism

4、of red coat color. Method The PCR-RFLP method was used to genotype the individuals. The bioinformatics and biotechnologysoftware was used to predict the secondary structure of MC1R.【Result The result showed that EE genotype was the dominant genotype in Chinese Holstein Blackand White herd while ee i

5、n Chinese Holstein Red and White herd. Secondary structure was changed that the deletion mutation caused the earlier terminating oftranslation, which led the form of red coat color.【Conclusion The allele E was mainly related to black coat color while e to red.Key words: Bovine; Red coat color; MC1R;

6、 Protein structure中国农业科学2021,41(8):2431-2435Scientia Agricultura Sinicadoi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.030收稿日期：2007-06-18;接受日期：2007-09-14基金工程：国家“863方案工程(2006AA1021D9、2007AA10Z169)、山东省农业科学院科研创新基金工程(2006YCX028)、山东省农业科学院青年科研基金工程(2006YQN038)作者简介：李秋玲(1979-),女，吉林敦化人，硕士，研究方向为动物遗传育种。E-mail ： liqiuling

7、2000 yahoo。通讯作者仲跻峰(1964-),男，江苏淮安人，研究员，博士，研究方向为动物遗传育种。E-mail ： zhongjifengtom0引言【研究意义】中国荷斯坦牛是中国产奶量最高、 数量最多、分布最广的奶牛品种，毛色以黑白花为主，偶尔出现红白花。由于过度追求品种毛色的统一性，红白花牛被当作不受欢送的个体。据德国统计，荷斯 坦黑白花牛产奶量8 092 kg,乳脂率4.16%,红白花 牛产奶量7 546 kg、乳脂率4.25%1。由此可见，红白 花牛的产奶水平虽然不及黑白花牛，但乳脂率较高，并有较强的耐热性。因而研究荷斯坦红白花牛红毛形 成的机制， 进一步培育出荷斯坦牛红白花新

8、品系成为 育种专家的重要战略目标。【前人研究进展】哺乳 动物毛发、皮肤的颜色主要是由黑色素的种类与分 布不同决定的。 黑色素可分为两种：黑色至棕色的 真黑色素(eumelanin )和黄色至红色的伪黑色素(pheomelanin )25。在黑色素的形成中促黑色素皮质素受体1 (melanocortin-1-receptor , MC1R)起着关 键的作用，它属于G偶联蛋白受体。牛MC1R基因位 于18号染色体6,编码区长954 bp,编码317个氨基 酸。野生型的E等位基因编码的蛋白质具有7个跨膜结构域、3个细胞内环和一个COOH-锚定到黑色素细 胞膜上。而MC1R ORF 310 bp处缺失

9、突变的e等位基 因编码的氨基酸发生移码突变产生一个早熟的平头MC1R蛋白，只有3个跨膜结构域7,表现或强或弱 的红毛表型811o本研究切入点】以MC1R为候选 基因，采用PCR-RFLP技术研究中国荷斯坦牛该位点 的多态性，并利用生物信息学方法预测野生型和突变型MC1R蛋白结构，探讨红毛形成机制。 【拟解决的 关键问题】研究中国荷斯坦牛MC1R基因的遗传变异，探讨红毛形成机理，为中国荷斯坦红白花牛的毛 色遗传学研究和育种工作提供理论根底和技术贮备。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验牛群试验牛群为222头中国荷斯坦牛，包才201头中国荷斯坦黑白花牛、21头中国荷斯坦红 白花牛，颈静脉采血，

10、ACD抗凝，20 c冻存备用。1.1.2主要试齐1JTaq DNA聚合酶、dNTP、pGEM-Teasy载体、DNA片段回收纯化试剂盒等均购自济南赛 恩斯生物技术。1.2试验方法1.2.1DNA制备用酚-氯仿抽提法提取试验牛基因组DNA ,溶于TE (Tris-EDTA )缓冲74L,4c保存。1.2.2引物设计和PCR扩增根据GenBank发表的牛MC1R基因序列(GenBank登录号NM_174108.2 ),用Primer 5.0设计引物。引物序列：PL ：5-GGTGAGTCTCGTGGAGAACG-3 , PR: 5-CGTAGAAGATGGAGATGTAGCG-3。引物由上海生工生

11、物 技术合成。PCR反响总体系为20心1包括10XPCR Buffer 2.0心20 mmol L-1MgCl21.5心2 mmolL-1dNTP 0.5从110 mmo1 L-1上下游引物各0.5 Taq DNA聚合酶0.3心DNA模板50 ng。PCR反响程序为：95 5 min, 1个循环：94 30 s, 57 30 s, 7230 s, 30个循环；72c延伸10 min , 4c保存。1.2.3 RFLP分析10心体系：3/PCR产物，0.3心1限制性内切核酸酶Mspl, 1.0111 10X酶切缓冲液，5.7口ddH2O, 37 C温育6 h,酶切产物用2%琼脂糖 凝胶电泳检测。

12、1.2.4克隆测序经PCR-RFLP分析后不同基因型个体的PCR扩增产物利用试剂盒回收纯化，回收后的DNA片段用pGEM-T easy载体连接，并转化大肠杆 菌DH&菌株，每种基因型单独挑2个克隆分别测序。1.2.5 MC1R蛋白结构分析对野生型和突变型的牛MC1R氨基酸序列进行蛋白结构预测，并运用Kyte-Doolitte方法和Emini原那么分别对蛋白疏水区、 外表暴露区及蛋白体系中的电荷分别进行预测。2结果与分析2.1PCR-RFLP结果2432中国农业科学41卷对所采集的本品进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝 胶电泳显示，特异性扩增良好，可直接进行RFLP分 析图1。PCR产物经M

13、spl酶切：日E得到160 bp和136 bp的片段；E/e得至ij 296 bp、160 bp、136 bp的片段；e/e得到296 bp的片段图2。2.2基因型频率及等位基因频率M I 2341、2：黑白花牛样本；3、4：红白花牛样本；M : Marker 20001, 2: The samples of Black and White cattle; 3, 4: The samples of Red and Whitecattle; M: Marker 2000M由由 耽耽e/c Nc Mi图2 MC1R基因的3种基因型Fig. 2 Three genotypes of the MC1R

14、 gene各种基因型频率及等位基因频率见下表，中国荷斯坦黑白花牛的等位基因主要为E E=0.970;中国荷斯坦红白花牛的等位基因主要为e e=0.905,并发现中国荷斯坦红白花牛存在E/e基因型个体。图1 MC1R基因的PCRT增产物Fig. 1 PCR products of MC1R gene表中国荷斯坦牛MC1FS因型频率和等位基因频率Table Genotype frequencies and allele frequencies of the MC1R gene of Chinese Holstein品种样品数BreedN基因型频率Genotype frequencies等位基因频率

15、Allele frequenciesE/EE/ee/eEeChinese Holstein Black and White201中国荷斯坦红白花Chinese Holstein Red and White21195600.9700.03002190.0950.9052.3测序结果通过测序发现，e/e基因型个体在MC1R ORF 310bp处发生G碱基缺失突变，E/e基因型个体在310 bp前测序结果非常好，但310后测序峰突然变得凌乱，且310 bp处G峰和T峰重叠，利用Mutation Surveyor软件将E基因单链和e基因单链峰图分别提取出来，比对这两个单链峰图，验证为E/e基因型。2.

16、4MC1R蛋白结构预测对野生型MC1R蛋白结构预测发现其成熟蛋白中至少形成7个a-螺旋，10个卜折叠，其中跨膜a-螺旋3个图3。按照Kyte-Doolittle的氨基酸亲水标准，可知野生图3野生型MC1RX级结构预测Fig. 3 Predicted wild MC1R secondary structure2060 SO 100 120 140 160 ISO 200 220 240 260 280 300 一螺旋一螺旋Atph品品RegkmDel ge & Roux & & - -折件折件Be值值, ,Regbons 卷曲卷曲 CaiJ,CaiJ, RegionsRe

17、gions中国农业科学2021,41(8):2431-2435Scientia Agricultura Sinicadoi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.030收稿日期：2007-06-18;接受日期：2007-09-14基金工程：国家“863方案工程(2006AA1021D9、2007AA10Z169)、山东省农业科学院科研创新基金工程(2006YCX028)、山东省农业科学院青年科研基金工程(2006YQN038)作者简介：李秋玲(1979-),女，吉林敦化人，硕士，研究方向为动物遗传育种。E-mail ： liqiuling2000 yahoo。通讯

18、作者仲跻峰(1964-),男，江苏淮安人，研究员，博士，研究方向为动物遗传育种。E-mail ： zhongjifengtom型MC1R亲水区A0是411、2734、6472、162 165、215 217、219 238、300 311区段；依 据Emini原那么预测MC1R外表暴露区为69、2731、6469、162164、224231区段，其中最有可能位 于蛋白质外表的区域为224231和300309区段；依据氨基酸带电情况，预测在多肽链上611、2832、6372、149155、158165、183188、207240、258262、276280、305308区段为正电荷 区，而14

19、18、33 44、53 57、76 86、92 96、100104、115127、131 135、267296、310317区段为负电荷区图4。对突变型MC1R蛋白结构预测发现其未成熟蛋白中只形成2个a-螺旋，5个&折叠，其中跨膜如螺旋3个图5。按口Kyte-Doolittle的氨基酸亲水标准，可知突变 型MC1R亲水区0是411、2734、6472、105131、143149区段;依据Emini原那么预测MC1R外表暴露区为69、2731、6469、106111、142 147区段，其中最有可能位于蛋白质外表的区域为106亲水性亲水性HydiupluUchy plcu-kyie-do

20、dliEile0外表坪彝区外表坪彝区aE北荷分布北荷分布Average-chargeSurccprobability plot-cmini-1 -图4野生型蛋白亲水性、外表暴露区及电荷分布预测Fig. 4Predicted hydrophilicity, surface and charge of wildMC1R 口口- -蛛成蛛成AlpliaLKugionsDel 2也也Kmix日日- -我我0 Bela. Reiyuhs- 卷卷iHl Coil. Regions-图5突变型MC1RX级结构预测Fig. 5Predicted mutational MC1R secondary struct

21、ure110和142145区段；依据氨基酸带电情况，预测在多肽链上611、2832、6372、107112区段为 正电荷区，而1418、3344、5357、7686、9296、100104、120131、148152区段为负电荷区 图6。亲亲水性水性HydnJphi屣屣ity Mobkyt小小表而暴盛恒表而暴盛恒&电荷分布.*向出咕仁Suriaict:Suriaict: prnbahiprnbahi I I ilyilypkrt-cmintpkrt-cmintA AJ1J1_ _ _ - - - - -i i r r - - -图6突变型蛋白亲水性、外表暴露区及电荷分布预测Fig. 6

22、Predicted hydrophilicity, surface and charge of mutational MC1R3讨论本研究采用PCR-RFLP和DNA测序技术，研究 了中国荷斯坦牛MC1R基因与毛色表型的关系，结果说明：中国荷斯坦黑白花牛中优势等位基因为EE=0.970,而中国荷斯坦红白花牛中优势等位基因为e e=0.905。e相对E是隐性基因，只有在e等 位基因纯合状态下，才表现为红色毛色12,13。本试验发现中国荷斯坦红白花牛中存在E/e基因型，测序结果显示MC1R基因编码区310位置以前测序结果非常 好，但310后测序峰比拟凌乱，并且310处G峰和T峰重叠。测序峰图经Mu

23、tation Surveyor软件分析后，证明所测序个体为E/e基因型个体。PCR-RFLP和DNA测序都证明中国荷斯坦红白花牛中确实存在E/e基因型个体。由此推测牛红色毛色除由MC1R基因控 制外，可能还有其它基因参与。DNA测序的速度远远超过蛋白质的测序和分析 速度，而且目前蛋白质结构测定和分析难度较大、费 用较高，且某些蛋白质难以形成晶体而无法进行结构 分析。因此，根据蛋白质序列预测蛋白质可能的结构 显得非常重要。MC1R是G蛋白偶联受体2434中国农业科学41卷G-protein-coupled receptor, GPCR超家族的成员之一，它在表皮和毛囊的黑色素细胞中表达。MC1R可

24、被促肾上腺皮质激素和0促黑素ofmelanocytestimulating hormone ,a.MSH激活14，参与cAMP信 号通路偶联，刺激真黑色素合成，使动物表现黑色肤 色或毛色。假设aMSH不能与MC1R结合将导致伪黑色素合成，使红色或黄色色素沉着。E等位基因编码的MC1R蛋白具有激活腺甘酸环化酶功能，细胞内cAMP浓度升高，激活c基因使酪氨酸酶合成增多， 使真黑色素合成增多，伪黑色素合成减少，于是形成 黑色毛色表型15。Sanchez等16报道Thr314、Cys315和Trp317是MC1R蛋白与“-MSH结合的关键氨基酸。 本研究应用生物信息学技术和分子生物学软件，对野MC1R

25、蛋白二级结构进行了ORF 310处核甘酸的缺失突MC1R蛋白移码突变在核酸 如螺旋和卜折叠结构明显减 少，外表暴露区和电荷区也明显缩短，翻译出来只有155个氨基酸的不成熟蛋白，功能发生变化，这样的 受体不能与纷促黑素a-MSH结合17,但可能与Agouti蛋白结合1820 ,所以最终可能使以伪黑色素为 产物的途径被激发，导致中国荷斯坦牛红色毛色的形 成。这个区域可能是MC1R受体的关键局部，人和马 的Extension位点与毛色有关的大多数点突变都在这 个区域，这个区域的点突变已在人上发现与红发、红 肤2124和癌症25,26有关，因此深入的研究该区域与色 素沉积形成的机制，将有可能应用到人类

26、肤色和皮肤 癌研究上。4结论本试验利用PCR-RFLP和DNA测序技术建立了MC1R隐性e等位基因的检测方法，并在6个中国荷斯坦牛家系中证实了E等位基因主要与黑色毛色形成 有关，e等位基因主要与红色毛色形成有关，为毛色 遗传学提供了分子鉴定方法，而且为不同的红毛表型深与浅是否由同一位点控制提供了一个简便工具。此方法经熟化后可用于DNA鉴定携带红毛e等位基因的种公牛，为奶牛育种提供参考。References1秦志锐.奶牛良种引种指导.北京：金盾出版社，2003: 41.Qin Z R. Elite Introduction Guider for Dairy Cattle . Beijing: J

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32、thegene for melanocyte-stimulating hormone receptor (MC1R) is associated withthe chestnut coat color in horses. Mammalian Genome, 1996, 7: 895-899.11Kijas J M, Wales R, T? rnsten A, Chardon P, Moller M, Andersson L. Melanocortinreceptor 1 (MC1R) mutations and coat color in pigs. Genetics, 1998, 150:

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35、序列468处停止了翻译，8期李秋玲等：中国荷斯坦牛红毛基因变异及其编码蛋匕结构预测2435protein levels by its natural agonist and antagonist. The FASEB Journal, 2003,17: 2154-2156.15Garca-Borr n5 J C, Smchez-Laorden B L, Jim(nez-Cervantes C. Melanocortin-1receptor structure and functional regulation. Pigment Cell Research 2005, 18:393-410.16

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