本科生《P》3-第三章载体3-12

1、Princple and Technology of Genetic Engineering基因工程原理基因工程原理Professor, Dr. Degang Zhao (赵德刚赵德刚)Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering, College of Life Sciences, Guizhou University E-mail: 1第三章第三章 基因工程载体基因工程载体 教学目的与要求：教学目的与要求：1）掌握基因工程常用载体特点掌握基因工程常用载体特点2）掌握基因克隆的基本方法掌握基因克隆的基本方法2第一节第一节 载体的定

2、义载体的定义 3载体（载体（Vector）是指在寄主细胞内能自我复制，并能够作为是指在寄主细胞内能自我复制，并能够作为运输载体将重组运输载体将重组DNA分子转移到寄主细胞的分子转移到寄主细胞的DNA分子。（分子。（A DNA molecule that is capable of replication in a host organism, and can act as a carrier molecule for the construction of recombinant DNA.）基因克隆载体：基因克隆载体：能承载外源能承载外源DNA带入受体细胞，并在其中带入受体细胞，并在其中自我复

3、制以维持和扩增外源自我复制以维持和扩增外源DNA的一类的一类DNA分子，又称为分子，又称为DNA克隆载体。克隆载体。 基因表达载体基因表达载体Require in a vector: Cloning sitesOrigin of replicationSelectable markerSafety载体应该具备记到主要条件，以载体应该具备记到主要条件，以pBR322为例进行说明：为例进行说明：1克隆位点克隆位点:在在DNA分子合适的位置有分子合适的位置有1到多个克隆位点，可供外到多个克隆位点，可供外源源DNA片段插入克隆载体片段插入克隆载体DNA分子中。分子中。2复制起点：具有复制起点，外源复制

4、起点：具有复制起点，外源DNA插入载体后，仍可由复制插入载体后，仍可由复制起点起始复制过程。起点起始复制过程。3筛选标记基因：具有用于选择克隆子的标记基因。筛选标记基因：具有用于选择克隆子的标记基因。4安全性：克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的安全性：克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，且不能转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人基因，且不能转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。的细胞。 pBR322为例说明负筛选法：为例说明负筛选法：首先用不含首先用不含AP和和TC的培养基，两的培养基，两种都长，然后选取一些菌落，在含种都长，然后选取一些菌落，在含

5、AP的培养基上培养，不长的，的培养基上培养，不长的，说明有外源基因插入说明有外源基因插入AP位点，到不含位点，到不含AP和和TC的培养基的培养的培养基的培养基上找到相应的点。基上找到相应的点。第二节第二节 质粒载体（质粒载体（Plasmid vectors） 6一、质粒的定义一、质粒的定义质粒（质粒（Plasmid）: 一种存在于细菌、酵母等寄主细胞中一种存在于细菌、酵母等寄主细胞中染色体外的裸露双链染色体外的裸露双链DNA分子分子（a circular DNA molecules, found in nature, in bacteria and some yeasts. pDNA）。）。大

6、小一般可从大小一般可从1千多个碱基到千多个碱基到100多多kb，多数在，多数在10kb左左右。右。 拷贝数：拷贝数：一个寄主细胞中某种质粒质粒的数量与染色体数量之比。一般寄主细胞只有一套染色体。 按照拷贝数的多少，可以将质粒划分为严紧型质粒和松弛严紧型质粒和松弛型质粒型质粒。当拷贝数在1-10之间时，通常称为严紧型质粒。很多大质粒是严紧型质粒。当拷贝数多于10个时，通常称为松弛型质粒，小质粒一般是松弛型质粒。 严紧型质粒和松弛型质粒之间没有严格界限。 某种质粒对于某种寄主来说，拷贝数一般是一定的，拷贝数的存在是因为质粒上存在cop基因基因，它可以指令寄主细胞合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数后

7、，阻遏物也达到一定量，就阻遏质粒进一步复制。Number of Copies：一个寄主细胞中某种质粒的数量与染色体数目的比值。一个寄主细胞中某种质粒的数量与染色体数目的比值。Based on the number of copies of the plasmid found in the host cell: low copy number plasmids, stringent(严紧型) control of DNA replication High copy number plasmids, relaxed plasmid(松弛型) 按照是否含有trans基因将质粒分为结合型质粒和非结合型

8、结合型质粒和非结合型质粒质粒。 Trans基因是一种可以指令寄主细胞产生鞭毛，合成细胞表面物质，促使寄主细胞与其他细胞相接合，导致遗传物质从一个细胞转移到另一个细胞。我们把含有trans基因的质粒称为结合型质粒，把不含有trans基因的质粒称为非结合型质粒。 在基因工程中我们一般选用什么样的质粒？在基因工程中我们一般选用什么样的质粒？松散型、非结合型松散型、非结合型 质粒的命名：质粒的命名：p，plasmid表示质粒，随后的两三个大写字母表示谁发现和发明了该质粒，数字表示质粒分离的次数或者构建的一系列质粒的编号。 例：pBR322二、质粒克隆载体二、质粒克隆载体 质粒经改造后即可成为基因工程载

9、体。如前述质粒经改造后即可成为基因工程载体。如前述pBR322，载体需，载体需有克隆位点和标记基因。标记基因种类很多：有克隆位点和标记基因。标记基因种类很多：1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因代谢抗性基因: 抗除草剂基因抗除草剂基因 2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）。主要是参与氨基酸，）营养标记基因（可直接用于选择转化子）。主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需

10、营养物合成酶类的基因，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这类基因在酵母这类基因在酵母转化中使用最频繁，如转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。等。3）生化标记基因。其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如）生化标记基因。其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT。 葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 该基因编码一种可分解各种该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多

11、生物中没有这种基因。十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。荧光素酶基因荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高，可使灵敏度提高10倍；或由发倍；或由发光细菌（光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。的变化测定酶活。发光蛋白质基因发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可发光蛋白是由水母产生

12、的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。使大肠杆菌菌落呈蓝色。 半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ 和和lacZ） 半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链和链。前链。前者负责四聚体装配，后者具者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个互补作用。这两个部分可独立存在，部分可独立存在， 分别由两个基

13、因编码。为分别由两个基因编码。为链编码的基因称之链编码的基因称之为为lacZ(编码编码145 AAs)。这两个基因（。这两个基因（LacZ和和LacZ）均可作为）均可作为标记基因。标记基因。 半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观水解为兰色产物，检测直观 b. lacZ编码编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大三、构建质粒克隆载体的基本策略（三、构建质粒克隆载体的基本策略（Slightly more exotic S

14、lightly more exotic plasmid vectorsplasmid vectors）1 能在转化的受体中进行有效复制、有较多拷贝数（松弛型的质粒ori）。2 克隆位点：尽可能多一些，至少有一个。可用 MCS连杆，MCSMCS是指含多种内切酶识别序列的多克隆位点（multiple cloning site），又称多聚接头多聚接头（polylinker）。3 筛选标记基因：选择标记区内有合适的克隆位点，当外源DNA插入时，标记gene将失活而成为筛选的标识。4 构建的质粒克隆载体应尽可能小。大于15kb的plasmid转化效率明显。5 根据需要，使构建的质粒克隆载体组装各种“元件

15、”（小DNA片段）。如插入启动子，终止子。Puc18/19克隆载体：克隆载体：1. 2.68kb2.ori来源于松弛型质粒ColE1的复制起始位点，可在大肠杆菌E.Coli HB101,E.Coli C600等细胞中高效复制（DH5）。3.含报告基因LacZ，lacZ取代了pBR332中的Tcr基因。 P LacZ LacZ 转录转录 翻译翻译 pUC18 BamHI片段片段重组重组DNADNA分子分子 转化转化E.coliE.coli 外源外源DNA DNA BamBamHIHI片段片段 涂布在含涂布在含X-Gal和和Ap的平板上的平板上,白色菌落为重组白色菌落为重组子，子，兰色菌落兰色菌落

16、为为原载体原载体利用利用LacZ基因筛选重组子基因筛选重组子pUC18/19中lacZ序列筛选：lacZ来源于乳糖操纵子，含有启动子、调节因子和-半乳糖苷酶的-肽基因（lacZ）。该基因产物在含IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）培养基培养时，菌落是蓝的。阳性克隆（转化子）是白色的。pUC系列质粒载体由系列质粒载体由Messing et al.构建，具有三个显著特点：构建，具有三个显著特点：1.分子量小，仅为分子量小，仅为2.7KB，容纳外源，容纳外源DNA量增大量增大2.易于检测是否有外源易于检测是否有外源DNA插入的标记基因插入的标记基因

17、LacZ3.多克隆位点区多克隆位点区 1) 多克隆位点成对地存在于多克隆位点成对地存在于pUC18和和pUC19中，位点排列顺序中，位点排列顺序相同，但方向相反相同，但方向相反,有利于外源有利于外源DNA的克隆和定向插入的克隆和定向插入 2) 产生不同末端规律排列产生不同末端规律排列: 两端限制酶位点产生两端限制酶位点产生5-突起端突起端（EcoRI和和Hind),与之相邻的两个限制酶位点产生与之相邻的两个限制酶位点产生3-突起端突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI),中央四个限制酶位点产生中央四个限制酶位点产生5-突起端突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入或平端。这种排列方式十

18、分有利于插入DNA片段的单向缺失和缺片段的单向缺失和缺失片段的回收。失片段的回收。EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rpUC familyPolylinker or multiple cloning site MCSEcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst

19、 SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)rpUCm-T载体载体(pUCm-T Vector):1 线性化线性化的载体，2 载体每条链的3端带有一个突出的T。第三节第三节 大肠杆菌的噬菌体载体大肠杆菌的噬菌体载体（Bacteriophage vectors for use in E. Coli )一、噬菌体的定义（一、噬菌体的定义（What are bacteriophages） 噬菌体是吃细菌的病毒颗粒（viruses, “eater of bacteria”）。CapsidtailGene 3 protei

20、nCoat proteinDNAPhages fall into three main groups:(1) tailless(2) head with tail(3) Filamentous（细丝（细丝状）状）Genetic material:(1) single-stranded RNA (2) double-stranded DNA病毒由DNA（or RNA）、外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。进入宿主细胞后，利用宿主细胞的合成系统进行DNA（or RNA）复制和壳蛋白的合成。DNA和RNA不能共存于同一种病毒中。噬菌体有严格的宿主专一性，限制了其作为载体使用的范围。温和噬菌体温和噬菌

21、体（Temperate phages ）：）：插入宿主染色体DNA随着宿主细胞的复制而复制溶原阶段（Lysogenic Cycle）烈性噬菌体烈性噬菌体（Virulent phages）：不插入宿主染色体DNA自主复制溶菌阶段（Lytic Cycle）二、二、噬菌体载体（噬菌体载体（Vectors based on bacteriophage ）1.DNA的特点的特点1) DNA：噬菌体中的DNA，线状线状，48.5kb，编码46个基因，集中于头部。2) cos位点位点：左右两端各12个核苷酸组成的5-粘性末端。两者核苷酸序列互补，DNA在包装前是线状的，在包装后是环状的。3）46gene：成

22、簇排列。不是所有gene都是生长必需的。 Capsid components 衣壳合成从A到J基因左侧区 Integration & excision 分裂合成（阴影区为基因操作中非必需部位） Early (late) regulation 早、晚调节 DNA synthesis DNA合成 Lysis 释放4）有 56种限制性核酸酶的酶切位点5）噬菌体的生长途径有两种。Lysis of cell and release ofmature phage particlesInductionLysogenic responeCell divisionLytic responepSuch a

23、s ultraviolet lightAssembled or packaged5）噬菌体的生长途径有两种。噬菌体载体感染噬菌体载体感染E.coliDNA注入细胞注入细胞（溶菌阶段）（溶菌阶段）cos位点连接位点连接复制复制在在R和和S蛋白作用下细胞破裂蛋白作用下细胞破裂噬菌体载体感染噬菌体载体感染E.coliDNA注入细胞注入细胞（溶原阶段）（溶原阶段）在宿主细胞在宿主细胞int基因作用下插入宿主染色体基因作用下插入宿主染色体复制复制紫外线紫外线2.噬菌体作为克隆载体的依据噬菌体作为克隆载体的依据噬菌体温和噬菌体，感染性高，易操作。噬菌体可承载大的外源DNA。可承载的外源DNA为DNA的75

24、%-105%（即38-51kb）且DNA上有20kb的区域对噬菌体并非必需，可取代或缺失。3.噬菌体载体类型噬菌体载体类型噬菌体载体有两种类型，即插入型载体（Insertion vectors）和替换型载体（replacement vectors or substitution vector）。1.插入型载体插入型载体（Insertion vectors）：多用于cDNA构建文库。1）免疫功能失活型 如gt10，其左、右臂之间有一个CI基因，该基因应用了imm434免疫区段。该区段完全时，出现浑浊的噬菌斑噬菌体进入溶菌阶段；该区域被破坏时，CI基因失活，结果产生清晰的噬菌斑。可以通过形态学上的

25、差异将两者分开。2) -半乳糖苷酶失活型 如Charon 16A，gt11。2.替换型载体替换型载体（replacement vectors or substitution vector）常用于基因组文库构建在左右臂之间有填充物，可以被外源DNA所取代，中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA序列将被替换掉。Stuffers和polystuffer区可以被替换掉。EMBL4：当用两端酶切位点时，中间也可以用其他酶切割一下，以防原噬菌体片段退火。Charon40：中间含有多节段区（polystuffer），MCS是反向重复序列。两者可容纳外源

26、DNA能力9-22kb之间。 使用替换型载体克隆外源使用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：包括三个步骤： 用恰当限制性酶消化载体，除去基因组中可替代的部分将上述所得DNA臂同外源DNA相连接 重组体的DNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的重组噬菌体图3-8 置换型载体组成示意图图3-9 EMBL3 载体结构示意图Phagemids (phasmids): the phage functions are expressed, for example, ZAP family by strategene.二、凯伦噬菌体载体二、凯伦噬菌体载体凯伦噬菌体载体（Charon vector）是F.R

27、 Blattner在1977年在噬菌体基础上发展出来的一种特殊噬菌体载体。Charon：是古希腊神话中一名老摆渡工，专门负责在斯蒂克斯河（River styx）上，运送亡灵到阴间。 容纳能力 感染效率质 粒：n kb-n bp 低，0.1%转化率 噬菌体：大片段，n kb-23 kb 高 几乎每个颗粒都有100%感染率 图3-11 GEM -II载体结构示意图三、三、M13噬菌体噬菌体 M13噬菌体是一种丝状（filamentous）噬菌体，内含有环状环状、单链单链DNA分子（“+”链DNA）,长为6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息，可分为10个区。还有一个长507个核苷

28、酸的基因间隔区（IS区），从第5489个核苷酸到第6005个核苷酸。M13的复制起点定位在基因间隔区内，但IS区内有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。可编码三类蛋白质： 复制蛋白质 （基因，） 形态发生蛋白质 （基因，） 结构蛋白质 （基因，）M13mp18 M13噬菌体周期：噬菌体周期： M13噬菌体通过鞭毛吸附，感染雄性大肠杆菌，M13噬菌体的“+”链进入细胞内，以此为模板，复制互补的“-”链DNA。由此产生的双链M13DNA称为复制型复制型DNA（RF-DNA）。RF-DNA按一般环状双链DNA进行复制。

29、 当细胞内RF-DNA达到近200个拷贝时，则RF-DNA中的“+”链DNA被单链特异的DNA结合蛋白结合，阻止“+”链DNA的复制合成。结果，细胞内只能以“-”链为模板不断复制合成新的“+”链DNA。 新合成的“+”链DNA立即被积累在细胞内的壳蛋白包装成新的噬菌体颗粒，并不断挤出宿主细胞。 （ 单链，“+”链存在于噬菌体中，双链DNA存在于宿主细胞中。 ）M13噬菌体周期的特点：噬菌体周期的特点：增殖过程不会导致宿主细胞的溶菌生长，被感染的细胞一个世代可以释放1000个子代噬菌体。M13包装DNA分子的能力可达M13DNA本身的6倍。制备的M13DNA，单、双链均可转染大肠杆菌受体细胞，因

30、此M13DNA作为载体时，不必进行体外包装就可以直接转染受体细胞。第四节第四节 原核生物应用的其他载体原核生物应用的其他载体一、一、cosmid质粒载体质粒载体噬菌体特点：两端部少于280bp，且含有cos位点，可以插入36.4-51kb长度的DNA； 质粒克隆载体特点：不用包装即可转导。克隆能力一般不超过10kb，载体大小一般也在10kb以下，是环状双链DNA.cosmid质粒载体质粒载体特点：将噬菌体载体的cos位点和质粒克隆载体相结合，大约4-6kb长，能够容纳47kb的外源DNA。Cosmids: The vector be made up of plasmid sequences j

31、oined to the cos sites of phage, about 4-6kb in length, can accommodate cloned DNA fragments up to some 47kb in length.二、噬菌粒载体二、噬菌粒载体 M13噬菌粒载体（噬菌粒载体（ M13噬菌粒噬菌粒和质粒）和质粒）优点是可以用来制备克隆基因的单链DNA。不足之处：A. 插入外源片段后，遗传稳定性下降，外源DNA越大越严重。B外源片段只按一种方向插入；C接受外源DNA能力有限，小于1500bp。噬菌粒载体特点：噬菌粒载体特点：A. 分子量一般都比M13载体小，约3000bp，易

32、于操作；B. 可得到10kb的外源DNA单链序列；？C. 有质粒和噬菌体的复制起点，因此在大肠杆菌寄主中可以按正常双链质粒DNA分子形式复制；在有辅助噬菌体时可以按M13形式复制；D. 可以从噬菌体直接测序。例： pMB1 replicon（复制子）: 体外包装，感染，质粒型复制 可容纳外源DNA片段：30-45kb； 基因组文库中使用。 Genome mapping （酵母人工染色体 亚克隆）。第五节第五节 真核细胞应用的载体真核细胞应用的载体 1 Ti 质粒（质粒（ Ti：Tumor-induce肿瘤诱发）肿瘤诱发）根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与Ti质粒

33、的G-菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：冠瘿瘤细胞具有以下特征：1）不需要补充植物激素便可进行离体培养；2）合成肿瘤特有的化合物冠瘿碱(opine)，能专一的为根癌农杆菌所利用。这两个特征由Ti质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。 Ti 质粒存在于根癌农杆菌中，大小为90-150 x106道尔顿,结构是环状双链DNA,160-250kb，具六个功能区： 致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素； 冠瘿碱（opine）合成区：参与冠瘿碱合成； 冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解； Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的

34、接合转移； 毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体； DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制。Ti 质粒 (160-250 kb)T-DNA Vir Rep tra tra分裂素Opine合成分解 25 bp重复区25 bp重复区Agrobacterium oriOpine synthesisT-DNALBRBCytokinin synthesisAuxinsynthesisVirulence geneConstruction of Ti plasmid合成氨基酸衍生物合成氨基酸衍生物-冠瘿碱冠瘿碱Anxin synthesis gene：合成细胞分裂素合成细胞分裂素合成吲哚乙酸合成

35、吲哚乙酸Cytokinin synthesis gene：Opines synthesis gene：Ti 质粒类型（由Ti 质粒所产生的冠瘿碱种类而定）有： 章鱼碱类(octopine)； 胭脂碱类(nopaline)； 农碱类(agropine)T-DNA ：Ti质粒中与植物染色体结合的部位称为T-DNA。T-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25 bp重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧25 bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。Ti 质粒 (160-250 kb)T-DNA Vir Rep tra tra分裂素Opine合成分解 25 bp重复区25 bp重复区2.T

36、i质粒载体的中间载体（质粒载体的中间载体（intermediate vector）Ti质粒作为载体的问题：质粒作为载体的问题：1）太大，不易转化2）无适合克隆位点3）T-DNA致瘤区合成植物生长素和细胞分裂素，使转化细胞成瘤状，不能成为完整植株Ti质粒载体的中间载体由几部分组成：质粒载体的中间载体由几部分组成：A. 适合E.Coli和A.Tumfaciens自主复制和选择用标记基因B. 适合于植物细胞选用的标记基因C. 一段来自天然Ti质粒的部分T-DNA序列（提供同源重组）D1-2个来自T-DNA边界的25bp重复序列E用于表达外源基因的DNA序列（如启动子、终止子序列）Modified T

37、i plasmidDelete： genes of the production of bacterial food and of plant hormonesInsert： selectable marker genepCAMBIA1301pCAMBIA1301质粒质粒T-Border(right)Nos 3Gus35S5NcoI35S5Hyg(R)T-Border(left)35S3HinDIIISalIBamHIEcoRIBstEIIpCAMBIA130111837bpLac Z植 物 细 胞Ti 质粒植物根部植物根部羟基乙酰丁香酮羟基乙酰丁香酮乙酰丁香酮乙酰丁香酮植物细胞植物细胞单链单

38、链-DNA-DNAFormation of crown gall 植物根部受伤部位分泌乙酰植物根部受伤部位分泌乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酸丁香酮和羟基乙酰丁香酸诱导诱导TiTi质粒质粒virvir基因及根瘤菌基因及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达染色体上的一个操纵子表达virvir基因产物将基因产物将TiTi质粒上质粒上T-T-DNADNA单链切下单链切下根瘤菌染色体上的操纵子表根瘤菌染色体上的操纵子表达产物与单链达产物与单链T-DNAT-DNA形成复合形成复合物物复合物转化植物根部细胞复合物转化植物根部细胞 3Ti质粒的转移过程质粒的转移过程T-DNA Integrating to plant

39、genomeT-DNA Integrating to plant genome 二、酵母应用的质粒载体二、酵母应用的质粒载体以大肠杆菌质粒为基本骨架，具有酵母的以大肠杆菌质粒为基本骨架，具有酵母的DNA复制起始区，选复制起始区，选择标记，有丝分裂稳定区和外源择标记，有丝分裂稳定区和外源DNA插入位点。插入位点。Yeast episomal plasmids（YEps 附加型质粒）附加型质粒）：在：在pBR322中插入酵母筛选标记中插入酵母筛选标记ura3和和2质粒质粒DNA片段（复制起始部位和片段（复制起始部位和rep基因），拷贝数高，稳定。以附加体形式在真核细胞中复制。基因），拷贝数高，稳定

40、。以附加体形式在真核细胞中复制。（yeast 2 plasmid, may replicate autonomously or integrate into a chromosomal location.） Yeast integrative plasmids（YIps 综合型整合质粒）综合型整合质粒）：含有：含有酵母的筛选标记酵母的筛选标记ura3基因，但缺乏酵母的复制起始位点，所以，基因，但缺乏酵母的复制起始位点，所以，它只有整合到酵母染色体中才能复制。（它只有整合到酵母染色体中才能复制。（Yips are designed to integrate into the chromosome in a similar way to the Yep plasmid.） Yeast replicative