细胞生物学--细胞生物学教案doc

1、细胞生物学教学方案第一章 序论第一节 细胞生物学的特点1 2 3第二节 细胞学和细胞生物学发展简史Aristotle的名言 一 细胞的发现 Robert Hooke A.V. Leeuwenhoek二 细胞学说的建立 Schleiden Schwann 细胞学说的主要内容 1. 2. 3. Virchow(1858)的名言 1 2 二细胞学的经典时期 1 原生质和原生质体概念的提出 Mohl l804原生质(protoplasm)1880原生质体 (protoplasm) 2 细胞分裂的研究 1841 Remak amitosis Flemming mitosis Beneden meiosi

2、s 3 重要细胞器的发现Altmann1894 mitochondrion Golgi Golgi bady三 细胞学的分支1遗传学的发展(1) Beneden1876 精卵细胞染色体数只是体细胞染色体数的一半(2)1900 Mendl孟德尔定律的重新发现(3)1905 Wilson发现性别和染色体的关系 Weissman 预见遗传单位有次序的排列在染色体上 (4) Sutton 染色体学说 染色体行为和遗传因子联系起来.(5)1910 Morgan 连锁 基因图2 细胞生理学3 细胞化学四 细胞生物学的形成与发展 1953 Watson Crick DNA空间结构的发现 六十年代 "

3、;细胞生物学" 产生 七十年代 细胞生物学教学的开展 八十年代 分子细胞生物学的发展 九十年代 分子细胞生物学高科技手段的发展和运用 DNA指纹 PCR技术 杂交瘤技术的运用 第二章 细胞基本知识第一节 非细胞形态的生命体 1 朊病毒(Prion) 巴布亚新几内亚一土著 库鲁病 笑死症 羊脑 风牛病 2 类病毒 3 病毒第二节 原核细胞1 支原体2 衣原体3 立克次氏体4 放线菌5细菌和蓝藻第三节 真核细胞基本知识概要1 三大系统 2 动植物细胞的比较 第三章 细胞生物学研究方法 自1680年荷兰学者列文虎克(Leeuven hoek)用单显微镜(单透镜)第一次看到酵母活细胞以来,人

4、们一直在努力改革和发展观察手段，来研究细胞较深层次的形态和结构。今天人们已经有了具有原子尺度高分辨本领的扫描隧道显微镜。与此同时人们还创造了一系列对细胞组分和细胞生理活动进行详尽分析的方法和手段,它们揭示了各种细胞结构及生物大分子在细胞内的功能和作用。为了提供大量均一的细胞作为生物学的研究材料,人们又发展了一系列细胞培养技术。这些培养技术已经给人类带来了极大的利益。可以认为，细胞形态结构的观察技术，细胞组分及功能的分析技术及细胞培养技术是细胞生物学赖以发展的三大技术手段。在这里我们只能对某些具有代表性的实验技术的基本原理和技术特点作一简单的介绍。希望学生通过本章的学习不但能了解实验技术本身，还

5、能够了解到细胞生物学这一实验科学的发展是和实验技术的进步休戚相关的,因此发展和开发先进的实验技术也是细胞生物学的一项重要内容。 第一节 细胞形态结构的观察方法一 固定法与活体观察法 固定法是以一定的化学物质的溶液(有时是气体)在尽可能保持细胞生活结构的情况下迅速杀死组织块。这一过程称为固定(Fixation)。然后制成薄切片,再染色(Staining)进行观察。这种方法比起观察活细胞有三个优点:第一,它能清楚地显现细胞的细微构造,如关于染色体,各种细胞器、细胞膜和细胞壁的微细构造都是靠这种方法阐明的。第二,这种方法的制片一般均能保存很久,便于前后研究各种现象之比较。第三,应用范围广,几乎可用于

6、所有的组织细胞。 这种方法不仅在细胞学发展的历史上发挥过很大作用,而且在现代细胞学中也是重要研究手段之一。例如用电子显微镜研究细胞亚显微结构时通常都使用固定法。固定法在细胞化学的研究上也有广泛的应用。固定法的缺点是,在用固定剂(Fixative)杀死细胞的同时,常常难免使细胞的某些生活结构发生一定的变形。因此这种方法不能完全如实地反映生活细胞的情况。在实践上往往是能保存细胞某种结构的固定剂,却不能使另一些结构保留下来。例如,适于观察染色体的固定剂,对于观察线粒体就不合适。有人因为固定法的这种缺点而对它抱怀疑主义的态度。这是过分偏激的观点。事实上只要选择合适的固定剂,这种方法是能展示给我们细胞结

7、构的许许多多细节的。当然,另一方面在应用此法时也不应该忘掉它的固有缺点。在研究某种结构时,最好同时多用几种固定剂，对比分析所观察的现象，以免做出主观的判断。活体观察法的优缺点与固定法正好相反。它的优点是能够如实地反映生活细胞的情况。但完全做到这一点也并不容易，必须严格控制实验条件，最大限度地使所观察的细胞得到正常生活条件。活体观察的缺点是，显示细胞结构的精细程度较差。这和在活体情况下细胞内各种结构的折光率相近有关。相差显微镜的运用虽然在一定程度上可以克服这一缺点，但较之固定法在显示细胞结构的精细程度上仍大有逊色。 由于组织培养方法的进步，能够进行活体观察的细胞种类也大大增多。 固定法和活体观察

8、法各有优缺点，不能互相代替。只有结合并用，取长补短，方有利于全面认识细胞生活的真相。 二 各种显微镜 观察细胞离不开显微镜（Microscope）。这正象观察天体要用望远镜一样。常用的显微镜有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜等。 1、普通光学显微镜（Light microscope）的分辨本领各种显微镜识别微观物象的能力常用分辨力（resolving power）的概念来表示。分辨力是指能够区分相近两点的最小距离，能够区分的两点间距离越小，表示显微镜的分辨力越高。分辨力亦称分辨本领。显微镜的分辨力是由物镜决定的。它和物镜的镜口率、照明光线的波长有直接关系。分辨力

9、可按下式计算： 0.61 R=- (a) NAR-分辨力-照明光源的波长NA-镜口率（数值孔径） Sin NA= n - (b) 2 n-物镜与标本间的介质的折射率-物镜的镜口角 所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度（2-1）。镜口角小于180，故Sin1/2的最大值也小于1。 从公式（a）可以看出，为提高分辨力，光源波长(越小越好，而物镜的镜口率NA越大越好。按可视光线的波长(（400-700毫微米）为540毫微米，物镜的最大镜口率为1.3计算，R=0.25微米。这就是说，相近两点的距离小于0.25微米时，普通光学显微镜将不能分辨出这两点。因为可视光

10、线的波长可小到400毫微米。所以一般认为普通光镜的分辨本领的极限约为0.2微米。 细胞中的结构如染色体、线粒体、中心体、核仁等大于0.2微米，在光学显微镜中能观察到。这种结构称显微结构（microscopic structure）内质网的膜、核膜、微管、微丝等因小于0.2微米，在普通光学显微镜下看不到，称为亚显微结构（submicroscopie structure）。 从公式(b)可以看出，要增大镜口率必须提高物镜与标本间介质的折射率。空气的折射率为1，香柏油的折射率为1.515。因为要增大镜口率必须用油浸物镜。 2、暗视野显微镜 暗视野显微镜(darkfield microscope)是根

11、据丁达尔(Tyndall)效应的原理设计的。若在暗室中穿入一细束光线,那么由侧面观察时,那些在普通照明的散射光下看不见的空气中的细小尘埃颗粒,可以看得很清楚。这种现象称丁达尔现象。暗视野显微镜是因为视野内不能直接看到照明光线,只能看到被检物体散射或衍射的光线。故视野内呈黑暗状态。由于被检物体表面散射的光亮.才使我们能够在黑暗的视野中观察到被检物体的外形和运动。普通显微镜的最高分辨力如上所述为 0.2微米,而暗视显微镜虽然对被检物体的细微构造分辨不清,但却可看到0.004微米以上的微粒子的存在。这是普通光学显微镜所不具有的特性。暗视野显微镜与普通显微镜的构造差别,在于集光器的特殊。普通显微镜换上

12、暗视野集光器或用中心挡光法(用黑色厚纸或金属薄片制成圆形挡光片。放在普通集光器下面的滤光玻片上，挡住中央光束)。即可取得暗视野效果。用中心挡光法若想取得良好的暗视野效果，除了选择适当直径的中心挡光片外，还须考虑反射镜的角度，光源的强度等各种因素。常见的暗视野集光器是抛物面集光器（图2-2）。它的集光镜是一个单透镜，周围成斜度较小的抛物线形式。由显微镜的反光镜反射出的光线，被集光镜的中部遮光板所阻挡，但侧面光线则自由进入遮光板旁和透镜边缘之间的缝隙。这些光线在聚光镜的抛物面的凹面上发生折射,结果光线集中到聚光镜的界面以外,处于观察标本的平面上。由于直线进行的光束被遮光板挡住不能进入物镜,因此视野

13、变暗。而折射光线集中到标本的物镜结构时被散射非常光亮,通过物镜达到观察者眼中,故观察细胞的某些结构(尤其是细胞质颗粒)是亮的(图2-3)。 3、相差显微镜 人们在显微镜下观察被检标本时,只能靠颜色(光波的波长)和亮度(光波的振幅)的差别看到被检物的结构。活细胞近于无色透明,当光波通过它时颜色和亮度变化不大。因此在普通光学显微镜下细致观察活细胞的结构是很难的。 三十年代Zernike.F.提出相差显微镜(phase contrast microscope)的原理和设计,四十年代开始制造相差显微镜出售。由于有了相差显微镜,在一定程度上克服了上述困难可以直接看到活细胞中的结构变化。相差是指同一光线经

14、过折射率不同的介质,其相位发生的差异。那么什么是相位呢？相位是在某一时间上光的波动所能达到的位置。当光波通过两种不同折射率的物质时(如由空气入水,或由空气入玻璃),其波长、振幅和相位皆有不同程度的变化。例如,使光分别通过1公分厚的水和玻璃时,由于水和玻璃的折射率不同,通过它们的光波的相位产生一定差异（通过玻璃的光波的相位落后)。这个相位差异称相差(图2-4)。相差决定于光波所通过的介质的折射率之差与厚度,等于折射率与厚度的乘积之差。介质越厚或折射率越大,光波减速也越大。 光线的相差用肉眼分辨不出,只有利用衍射和干涉现象,把相差变为振幅差,即明暗之差,肉眼才能识别。光波通过小颗粒(物体)后产生直

15、射光和衍射光。后者的振幅较小,相位延后(图2-5)。当在光学系统中,这种直射光和衍射光相遇时,根据它们相位的异同,其振幅发生减小或加大的变化,使光线变暗或变亮,这种现象称为干涉。相差显微镜的工作原理如图2-6和图2-7所示。光线通过聚光镜下的环状光阑在物镜的焦点面聚光。载片上的物体A受来自环状光阑的光线照射,直射光在A处成像，而散发的衍射光一部分也由于物镜透镜的作用在A成像。这时观察者看到的是直射光和衍射光在A处干涉形成的像。但如果使用的是普通物镜，衍射光的相位落后1/4波长，并且比直射光的成像弱，因此干涉合成的光与背景光线的振幅差别很小。相差显微镜的物镜中安装有相板。相板有推迟直射光或衍射光

16、的相位和吸收光量，以调节直射光或衍射光的亮度的作用。利用相差物镜的相板，把直射光推迟1/4波长，使直射光和衍射光维持同一相位（图2-7、B）两者的光波由于干涉现象，其振幅为二者之和。因背景只有直射光,故被照射的物体比背景亮,称明反差(bright contrast)或负反差(negative contrast)。如用另一种相差物镜的相板,把衍射光推迟1/4波长,直射光的衍射光的相位差变成1/2波长,由它们干涉合成的光波振幅为二者振幅之差(图2-7、C),故被照射物体比背景暗,称暗反差(dark contrast)或正反差(positive contrast)。相差显微镜的装置和普通显微镜不同者

17、是前者聚光镜下加环状光阑.物镜里装有相板。另外有调轴望远镜。不同倍数的相差物镜要用相应的环状光阑。因此环状光阑有10×、20×、40×、100×等不同直径的,装配在一个旋转盘内,按需要调换使用。物镜的相板上有一个半透明环,环和环以外的部分涂有不同的物质,使通过的光线产生一定的相位差,以取得明反差或暗反差效果。用显微镜目镜看不清光阑亮圈和相板的环状圈。只有用调轴望远镜方能看清楚,以便转动调节装置,使两个环圈重合对齐。这样才能发挥相差显微镜的效能,看清活细胞的结构。相差显微镜的光源要用强光,并使用波长较短的单色滤光玻璃,通常用绿色玻片。4、荧光显微镜 某些物

18、质受紫外线照射时发出荧光(可视光线),这种物质称荧光物质。例如维生素A、核黄素、硫胺素等都是细胞内的天然荧光物质。用荧光显微镜(fluorescence microscope)可以观察这些荧光物质在细胞内的分布位置。另外给细胞中加入荧光染料(如中性红、甲基绿、吖啶橙、吖啶黄、刚果红等)可使细胞中某些物质受紫外线照射使诱发出荧光。例如固定的切片标本,用吖啶橙染色,经紫外线照射时可使细胞内的核糖核酸(RNA)发生红色荧光,脱氧核糖核酸(DNA)发生绿色荧光。荧光显微镜通常采用高压水银灯等做为发生紫外光的光源。在光源和反光镜之间放一滤光装置,把紫外线经过集光器照射到被检物体上使之发生荧光。此外,在荧

19、光显微镜的接物镜上方或目镜下方的镜筒中装设另一个滤光镜,把剩余的紫外线吸收掉,以保护眼睛,但使荧光能够通过。这样就可通过目镜观察细胞中的荧光现象(图2-8)。荧光显微镜有时在光源与标本间所用的透镜是用石英制成的,反光镜是涂铝的或为石英三棱镜。 5，电子显微镜(electron microscope) 可见光的波长制约了普通光学显微镜的分辨能力。人们在考虑可能替换的光源。1926年有人发现了磁场对电子束的聚焦效应，接着鲁斯卡(Ruska)借助于磁力线圈把电子束聚焦于尽可能小的点上。这两项研究成果奠定了制作电子显微镜的基础。1831年鲁斯卡等人通过试验证实了和光学成象的几何原理一样，电子照射的物体

20、也可以用磁电子透镜分二次放大的形式显示出来。1933年鲁斯卡制成了第一台电子显微镜，这台电镜被看作是当代各种型号电镜的祖先。他得到了500 A的图象。由于当时电镜技术尚不完善，他们研究的物质经常被强烈的电子束碳化。1939年鲁斯卡极大的改善了电子显微镜，西门子公司开始批量生产并成功的将电子显微镜推向了市场。1986年鲁斯卡与扫描隧道显微镜的发明人拜宁（Binning)等一起被授于诺贝尔物理奖。鲁斯卡在80高龄得到这次殊荣，是为了奖励他在24岁时发明的电子显微镜，他可能是历史上最老又最年轻的诺贝尔奖获得者。电子显微镜和光学显微镜的几何成象原理虽然一样,但分辨本领却有了显著的提高.这首先是由于电子

21、显微镜是用电子束作为照明的光源.电子束的波长远比光波的波长短.其次,电子显微镜使用的是电子透镜。光学透镜是由玻璃制成的可见物质透镜.与此相反，电子透镜不是肉眼可见的物质透镜,他是由磁或电所行成的局部空间来起透镜的做用.正如光学透镜使光线入射到玻璃时产生折射一样,电子束经过电子透镜也会产生折射.电子透镜共有三组,分别起类似光学显微镜的聚光镜、物镜和目镜(投射镜)的作用。 在电镜中,透过被检物的电子束投打到荧光屏上，电子能转换成光能,成为我们可观察到的影象。也可以让电子投射在感光板上,拍被检物的相片。那么电子束是怎么成象的呢?它和光学象的形成有何不同？在光学显微镜中，成象的反差度,即亮度差,是因被

22、检物的不同结构吸收光线的强弱程度不同造成的。就是说,入射电子与物质原子碰撞后产生散射,被检的不同部位有不同的散射度,这样就形成了电子象的浓淡.电子束的散射度是由物体的密度与厚之积,以及加速电压的大小决定的。 电子显微镜的结构是由镜筒(本体结构) 真空系统和供电系统三部份组成。 镜筒是由照明系统，标本室,成象系统和照相装置组成。最上部是做为电子源的电子枪.给其中的金属丝(钨丝)加热到达高温时电子就会从金属表面发射出来。发射出来的电子带负电荷,可背5-10万伏的高压电加速。电压越高电子加速越大，电子运动速度大致与电压平方根成正比.加速的电子束经第一个电子透镜（聚光镜）集拢并调节强度，照射到试料标本

23、上.然后在第二个电子透镜(物镜)成象和放大.物镜是电子显微镜的心脏.第三个电子透镜是投影镜（目镜）它起把物镜放大的象再放大的做用，即仅放大镜的作用. 所以，从镜筒的主要部分的构成看,电子显微镜和光学显微镜是相似的。但由于电子显微镜中是使用电子束代替照明的光源，故在构造上有以下主要特点： (1)空气对电子束起明显的阻碍做用，因此镜筒必须保持高度真空。所以电镜要配备真空泵装置。 (2)配备有加速电子用的高压电源. (3)为电子束的波长单一化,配备有稳压装置。 (4)为使电子象变成肉眼可见的光学象，在观察部位上设置荧光屏（观察室）和照相室. (5)放大倍数高的电镜在物镜和投影镜之间还装置一个中间镜,

24、以多一级放大。调节中间镜的电流,可在很大范围内变动放大倍数。 电镜观察的标本必须是非常干燥的，同时切片必须很薄(一般位200-900A)因为电子束是一中带电的粒子流,进入被检物体后与物质的电子和原子核发生作用而散射，故只能透过极薄的物体。 近年来，电镜的研究和制造有了很大的进展。一方面电镜的分辨率不断提高，透射电镜的分辨率由最初鲁斯卡发明电镜的10nm提高到了0.20.3nm，晶格分辨率已接近0.1nm;另一方面除透射电镜(Transmission electron microscope)、扫描电镜(Scanning electron microscope) 分析电镜(analytic ele

25、ctron microscope)外，还发展了其他种电镜。如高压电镜(high voltage electron microscope),加速电压在120KV以上的电镜即为高压电镜，如果电压超过500KV就称为超高压电镜。目前世界上最高的加速电压可以达到3000KV，电镜体积庞大，相当于二层楼房的高度。高压电镜主要特点是穿透力强，可用于观察较厚的样品，整体培养的细胞不需超薄切片即可观察内部的三维微细结构，如微丝、微管等。 6扫描隧道显微镜(Scanning tunneling microscope,简称 STM)。 人类永远不会停止对微观世界的探索，在电子显微镜发明大约半个世纪后，1981年拜

26、宁（Binning）等又发明了扫描隧道显微镜它的成象原理完全不同于光镜和电镜。基于量子力学原理，研究者们发展出了一系列高分辨显微镜。这些发明为人类打开了通向微观世界的一扇又一扇大门，使人类真正进入了纳米世界。 STM是这类显微镜的代表，它能探索微观世界物质表面原子排列的状况。STM的探头有一根探针，针尖只有一个原子的大小，探针的针尖接近但不接触观测样品的表面并且同时进行扫描.根据量子物理学原理，当针尖上的原子与样品表面的原子的距离小于1纳米时，针尖和样品间会产生隧道效应，即产生隧道电流.通过记录隧道电流的变化就可以获得样品表面原子排列的情况并把它转化为图像。 STM具有其他显微镜不可比拟的功能

27、和特点：（1）具有高分辨能力。它平行于物体表面的分辨率,即侧分辩率可以达到0.10.2nm，而垂直于物体表面方向的分辨率,即纵分辩率可以达到0.01纳米。（）具有搬移能力。STM不仅可以直接观察物质表面的原子排列情况，而且还可以通过探针对物质表面的原子或分子进行搬移.从而人们可以按着自己的意愿在原子水平上进行重构或组建新的材料。（3）具有刻蚀能力。STM能对物质表面进行刻蚀，通过计算知道一个大头针大小的地方就能记录下来象”红楼梦”那样的一部书.这为制作高密度信息储存文件和纳米的电子原件提供了新途径。（4）具有在多种多样下的工作能力。对于生物学研究尤其重要的是STM可以在真空、大气等多种条件下工

28、作。（5）不破坏样品，STM在工作时既不接触样品又没有高能电子束的轰击.因此，可以避免样品的变形。总之，STM的观察到的原子是目前人类所能直接看到的微观世界的最小尺度，这项技术已广泛应用于生命科学的研究领域。用STM得到的DNA照片使人类第一次清楚的看到了它的表面形态。可以肯定，STM等基于量子力学原理创建的显微镜将在纳米生物学研究领域发挥越来越重要的作用。第二节 细胞组分及功能的分析方法首先人们利用一系列显微镜对细胞及其结构进行了卓有成效的观察，并且结合一些化学手段确定了细胞器及一些大分子聚合物在细胞中的排布.如对细胞膜、细胞核、染色体、细胞分裂等的观察。在深入研究中人们不禁要问，这些细胞结

29、构的化学组成如何？它们在执行着什么样的功能？要解决这些问题只靠观察手段就不够了。随着科学技术的发展人们逐步创造了一系列分析细胞组分及功能的方法。这些方法大致可分为三种：第一种方法是把细胞及大分子分离出来进行研究，即分离分析法；第二种是不破坏细胞或组分，在原位进行组分和功能的研究，既原位分析法.第三种则是在细胞或细胞组分生活状态下进行的动态分析法。当然观察方法和分析的方法并没有严格的界限。正是观察方法和分析方法有机的结合才使得细胞生物学有了长 足的进步。 一、分离分析法 1、细胞分离技术 要对不同类型的细胞及组分进行详尽的分析研究，首先要得到一定量的同一类型的细胞，进而才能得到纯化的细胞器及其它

30、细胞组分。 可以用蛋白水解酶（胰蛋白酶和胶原酶）和钙鏊合剂乙二胺四乙酸（EDTA)处理组织，从中得到大量分上散较好的细胞悬液。再利用细胞不同的物理性质，通过沉降和离心把大小不同的细胞或轻重不同的细胞分离开。 利用免疫技术分离细胞是比较先进的方法。将某一种类型细胞表面特异性抗原的抗体与某种材料结合（如胶元、多糖小珠或塑料）形成集合表面。这样当各种细胞通过这一集合表面时，只有被这种抗体识别的细胞才能粘附在集合表面，然后用轻微的振荡或用酶破坏可溶性基质（如胶元）就可将同一类型的细胞回收。 目前流式细胞术和分类术（flow cytometry and serting,FCM, FCS)是一项较新的开拓

31、性技术，可以用此项技术来分离细胞。首先要用荧光染料偶联的抗体来标记需要分离的细胞，然后将这种混合的单细胞悬液样品和鞘流液（蒸馏水或等渗盐水）由气体压力装置送进流动室，使样品和鞘流液同轴流动。鞘流管末端成圆锥形，具尖端有70100um直径的孔，这样迫使细胞排成单行流出鞘流管尖端小孔进入样品流与激光束交叉区既检测区。通过振动荡流动室时细胞流束已成为小水滴。荷电环系对带有荧光细胞的小水滴充电。当带电小水滴通过高压偏转板时，充电的小水滴就会偏离原来的流向，而不带电的小水滴（其中含有未标记细胞）不偏向。收集偏向的小水滴就可以得到大量标记的特殊细胞。 现代流式细胞术是结合计算机科学、激光技术、单克隆抗体制

32、剂、定量细胞化学等的一项综和技术，它不但可以分离细胞而且还可以测量细胞的多种参数，其中包括象细胞大小、形状等不经染色处理就可直接测量的固有（intrinsic)参数，还包括经过的荧光剂染色后可测出的细胞DNA含量、RNA含量和细胞总蛋白量等的外源（extrinsic)参数。例如当排成单列的细胞通过激光束时，荧光染色的单个细胞受到激光束的激发，会产生荧光信号，信号检测器可测定出标记细胞上的荧光强度。从而对许多外源参数进行测定（表 ）。 流式细胞计可在1小时内分类收集一亿八千万个细胞，纯度可达9099%。可在1分钟内测出10000个细胞的DNA、RNA、蛋白质含量和细胞体积。此仪器应用广泛但价格十

33、分昂贵（图 ）。 2、细胞器及生物大分子的分离技术 通过细胞分离方法可以得到纯化的细胞群体，并且可以在细胞整体水平上进行研究。如果要深入研究各种细胞器及细胞内含物就需要用低渗、超声波等方法使细胞崩解，造成细胞匀浆，这一 过程叫做细胞的匀浆化（homogenigation)。然后便可以根据需要将亚细胞组分或各种颗粒分别分离出来。分离的方法主要应用的是离心技术。 离心机是一种借离心力把颗粒从中心向外推移的机器，当离心力超过地球引力时，悬浮在液体里的颗粒就会离开中心向外沉降。用普通离心机可以很快使红细胞沉降下来，也可把鲜奶分成奶油和较重的脱脂奶两部分。然而要分离亚细胞结构只有普通离心机是不够的。19

34、20年代，瑞典化学家斯维德伯格（Theodor Svedberg)发明了一种超速离心机，它的转数可达每分钟十几万转，产生的离心力相当于地心引力的几十万倍。超速离心机的出现极大的推动了细胞生物学的研究.有了一系列离心机还不够，为了更精确的分离研究对象，人们还创造了各种离心方法以适应不同研究层次的需要。(1) 差速离心法（differential centrifugation) 差速离心法是利用不同的离心速度所产生的不同的离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开.匀浆液在离心场中，不同大小的颗粒沉向离心管底部的速度不同，当离心力不高并且离心时间不长时，细胞核首先沉到管底。取出上清液进行离心并加大离

35、心力，这时可分离出线粒体，这样进行下去不断增大离心力，最后可分离出核糖体(图 )。怎样对分离出的物质进行纯度鉴别呢？一般有两种方法，一种是用电镜作形态学鉴定。更为简便的是利用各种细胞器的特征酶或特殊分子做生化分析。 用差速离心法对细胞器的分离只是初步的，要取得比较纯的细胞器还需要进一步的分离纯化。另外，经离心分离出核糖体以后所剩的上清液是可溶性部分和极微小的颗粒及一些生物大分子所组成。这些成分需要用更严格的超速离心才能分离出来，为此人们又发展出了密度梯度离心法。(2)密度梯度离心法(density gradient centrifugation)这种方法是利用离心溶液形成梯度来维持重力的稳定性

36、和抑制对流的。这需要在溶液中加入化学惰性物质，如蔗糖、甘油及盐类（如氯化铯、氯化铷）。这些物质不影响分离物的物理及化学性质，分离物的密度一定要在梯度柱密度的范围内，经高速离心后，不同密度的分离物就会集中在等密度带中而得到相互的分离. 蔗糖密度梯度离心 这种方法比较适合于对细胞器的进一步分离（表 ）。这需要预先制成不同浓度的蔗糖液（一般浓度在5%20%或10%60%）。用一定的方法在离心管中做成自下而上递减的浓度梯度，将待分离的悬液加在最上面，经超速离心，不同大小、密度的颗粒由于沉降速率不同，它们将会分别集中在不同的区带中，这样就达到了分离它们的目的(图 )。 氯化铯（CsCl)密度梯度离心 氯

37、化铯是重金属盐类，它的溶解度高，其溶液密度可达1.7g/ml，它在离心场中会自动形成密度梯度。用来分离的物质可直接和金属氯化铯溶液混合，然后进行等密度离心。这种方法适合于测定大分子或颗粒的浮力密度（图 ）。也就是说，它是根据检测对象的浮力密度的差异而不是根据他的大小来进行分离的.比如线粒体、溶酶体或过氧化物酶体的大小相近，但密度不同，我们可以根据浮力密度对它们做进一步的分离。这种方法的精确和灵敏是令人信服的，早在1957年人们就用氯化铯密度梯度离心技术将含有N标记的细菌DNA和未标记的细菌DNA分子分离开，这个经典实验直接证明了DNA的半保留复制。利用离心特别是超速离心技术对细胞及其组分进行分

38、离分析,在细胞生物学的研究中起着极重要的作用。例如，从对分离纯化出的线粒体和叶绿体的研究中人们了解到了这些细胞器在能量转化过程中的作用。用分离分析方法可以使内质网和高尔基体的封闭泡互相分离开。粗糙内质网经分离形成的小泡称微粒体（microsome)，它给内质网的研究带来了极大的方便.正是对微粒体分离研究使我们得到了关于分泌蛋白合成机制等许多成果。又如，在蛋白质合成机制的研究中，当初发现在细胞粗提液中能使RNA翻译成蛋白质。然后将粗提液分步分离，依次得到了核糖体、tRNA和各种酶，是否是这些物质构成了蛋白质合成体系呢？我们可以向这个体系中加入或不加入各种纯组分，这样就可以研究出每个组分在整个过程

39、中发挥准确作用。事实上，在研究细胞及其组分的功能过程中,分离分析的方法是在构建一种非细胞体系（cell-free system)。这种体系来源于细胞，但不具有完整的细胞结构，它包含了部分细胞提取物，这些提取物能够进行正常的生物学反应。用这种方法使细胞中各种生物学过程相互分开，不受细胞中复杂副反应的干扰，因而可以确定这些生物学过程的详细的分子机制。近年来，非细胞体系有了更广泛的应用，以非洲瓜蟾卵提取物非细胞体系为例，来自非洲瓜蟾的卵首先去胶膜后，经活化、裂解、然后超速离心，去掉上层脂类和下层卵黄、色素颗粒后剩下的提取物即是非细胞反应体系。向该体系中加入外源DNA，孵育一段时间后即可重构成新的细胞

40、核。人们利用这一体系研究探讨了许多细胞生物学的重要问题。如细胞周期调空、DNA复制，核膜及染色质组装、核质运输等。需要说明的是,离心技术有二个主要参数.一是离心力，一般用离心机的每分钟转数（r/min)来表示。文献中也经常直接用离心力（g)来表示。它们之间的换算关系是： 。二是沉降系数（sedimetation coeffient），它是用来表示大分子沉降速度的，各种大分子颗粒均具有一定的沉降系数。为了纪念诺贝尔奖获得者斯维德伯格，沉降系数的单位用了他的名字命了名，即斯维德伯格单位（Svedberg unit)，1S=1x1013秒，简称S。二、细胞的原位分析方法人们除了用分离的方法对细胞进行

41、研究外，同时还发展出了一系列对细胞进行原位分析的方法。顾名思义，这种方法要求被测定的物质必须保持在细胞的原来位置不动。一般的细胞化学方法都属于这一类。比如为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类等细胞组分，通常利用一些显色剂与被检物质中一些特殊基团特异性的结合，通过这种结合所产生的颜色和颜色深浅度的不同来判断各种物质在细胞中的分布和含量。四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，用以证明脂肪滴的存在。用氮-汞试剂与组织中蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应,形成红色沉淀。这是著名的米伦(Millon)反应。原位分析的方法很多，我们在这里仅作一简单的介绍.1 免疫细胞化学法在一些经典的蛋白质细胞化学反应中，如米伦反应、

42、重氮反应等，都只是一种一般蛋白质的定位反应，如果想了解其一特殊蛋白质的情况需要用特殊蛋白质的原位分析法。近些年发展起来的免疫细胞化学法（immunocytochemistry)开创了这方面研究工作的新领域.这项技术主要是利用抗原和其相应的抗体能作特异性结合即免疫反应这一原理，来定位组织或细胞中蛋白质抗原成分的一类技术。我们可以利用这一技术来对蛋白类抗原进行定位定性分析。虽然抗原和抗体的结合具有高度的敏感性和特异性，但是抗体与抗原的结合是看不见的，为了解决这一问题，早在四十年代Coons巧妙的使荧光素和抗体项结合，然后用这种被标记的抗体同被检测的抗原进行免疫反应，这样就很容易在荧光显微镜下检测到

43、组织或细胞中的抗原物质。从而创建了这项技术.后来，用于标记抗体的物质不断得到改进，先后出现了免疫酶标记技术、免疫铁蛋白技术。特别是1971年Faulk和Taylor创造的免疫胶体金技术是目前最受欢迎的免疫电镜技术。这项技术的特点是，胶体金能迅速而稳定地与蛋白质即抗体相结合.这是一种由于蛋白质被胶体金表面负电荷吸引而结合的过程。这种结合主要是物理过程，不会影响蛋白质的活性.另外金颗粒容易识别，能产生强烈的二次电子，是理想的扫描电镜的标记物。今天，免疫电镜技术已得到了广泛的应用，如分泌蛋白的研究、胞内酶的研究、一些结构蛋白的研究，包括膜蛋白的定位与细胞骨架蛋白的定位等。胶体金不但能与免疫球蛋白即抗

44、体相结合形成金标记抗体，而且还可以同其他蛋白相结合形成金标记酶、金标记凝集素等。因此金标记酶不仅可用于光镜和电镜的免疫细胞化学技术，还可以用于其它物质的检测。2 孚尔根(Feulgen)反应 1924年德国化学家 孚尔根（Robert Feulgen)在研究核酸时找到了一种方法，它只能使DNA着色，而RNA不着色。他发现DNA在细胞核里，特别是在染色体里。他用此方法证明，DNA普遍存在于动植物细胞核中。后来，人们称这种能特异显示DNA存在部位的方法为孚尔根反应。这一技术的基本步骤是：首先用酸处理已固定好的材料，酸水解可以除去RNA,保留DNA，并在DNA的嘌呤脱氧核糖苷键水平上除去嘌呤，使脱氧

45、核糖的醛基暴露。然后用希夫试剂(Shiff)处理，所暴露的自由醛基就会与希夫试剂起反应而呈现紫红色.在显微镜下可以看到紫红色的核，无色的胞质和核仁,即细胞核的福尔根反应为正，而胞质为负反应。核中异染色质区为强的正反应，核仁为负反应。3 原位杂交技术 福尔根技术可使我们了解到一般DNA在细胞中的存在位置.但如果我们想知道某段特殊核苷酸顺序在染色体上或在细胞中的确切位置，福尔根技术便无能为力了，这需要用原位杂交技术。 原位杂交（in situ hybridization)是一项核酸分子杂交技术（nuclear acid molecular hybridization technique)。其原理是

46、，两条具有互补核苷酸顺序的单链核苷酸分子片断,在一定条件下通过氢键的结合形成DNADNA,DNARNA或RNARNAd 的双链分子。进行原位杂交首先要制作探针，即对一段特异的核酸序列进行放射性同位素或荧光素的标记.然后要把所要研究的样品如细胞或染色体固定于载玻片上,并使DNA或RNA原位变性,再注入探针，使样品与标记的核酸进行原位杂交反应。将未反应的标记核酸分离后，用放射自显影术或萤光技术对杂交分子进行观察和定位。例如，1974年Steffensen等从HeLa细胞的多核糖体中分离出5SrRNA，并以I标记制成探针，并测探出5SrRNA的基因在染色体上的位置。具体过程是这样的，首先对载片上的人

47、体细胞中期染色体进行原位变性，并加入探针.这时，探针只能和产生它的模板DNA互补，即进行分子杂交，而其他部位则不行。放射自显影暴露二个月后，发现在所有制片的染色体组中，一对一号染色体均被标记，标记的位置是短臂末端，这说明5SrRNA基因位于第一号染色体的短臂末端。原位杂交技术首先是在光镜水平上发展起来的。近年来随着免疫电镜技术的不断进步，电镜原位杂交技术也得到了发展。电镜原位杂交和光镜原位杂交的基本原理是一致的，区别是探针的标记物不同，一般以生物素等一些小分子取代同位素或萤光素来标记特异核苷酸序列来制作探针进行原位杂交。然后用与胶体相连的生物素的特异性抗体对原位杂交样品进行免疫反应，这样就可在

48、电镜下观察到探针的位置，从而把特异核酸序列的定位与细胞的超微结构分析结合了起来。 三、 细胞动态分析的方法 事实上，在生活状态的细胞中生物大分子总是呈现动态变化的。人们早就希望能找到一些方法,可以对生物大分子进行动态的分析研究. 第一位在这个方向上努力的是德国生物化学家努普（Franz Knoop）。早在1904年他就用苯环标记脂肪分子对脂肪代谢进行研究，得出了在体内脂肪代谢过程中脂肪分子每次断裂下两个碳原子的结论。这个结果被40年后的进一步研究所证实。1913年德国化学家帕内斯（Fridrich Adolf Paneth）等人想到可以用放射性同位素标记生物大分子来研究大分子在细胞中的活动和代

49、谢情况。这样就有了放射自显影技术（radioautograpgy）。 放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对含有AgBr乳胶的感光作用来研究生物大分子在细胞内代谢过程的一种技术。开始，帕内斯等曾用放射性铅作为标记，然而铅的同位素极容易打乱活细胞正常的代谢过程。后来逐渐摸索到了一些常用的同位素（表 ）。这些同位素都是细胞生命活动中基本的起重要作用的元素。放射性同位素技术所以能被应用是由于存在两个基本条件，一是放射性同位素不影响机体的正常代谢。二是机体细胞对某种元素及其不稳定同位素“一视同仁”。该项技术的应用使得细胞生物学取得了很大的进展.例如象柠檬酸循环，尿素循环过程的发现；首次证明核仁是

50、合成RNA的场所；DNA半保留复制的证明等都是应用这项技术得到的成果。 制造带有放射性同位素的小分子并不复杂，只要把普通化合物放在核反应堆里用中子轰击，取出后就带有放射性同位素了。如今用于标记的几乎所有小分子前体都可以通过商品销售得到。因此现在这项技术的应用已十分广泛。这种方法的基本过程是，先使细胞含有示踪原子（例如H,C,P或其他）的化合物，然后把这种组织细胞做成切片，使液体乳胶涂于其上，经过一定时间的暴光（即放射性物质放出的射线落在乳胶上使其溴化银还原而析出金属银，这个过程称为自显过程，亦称曝光），再进行显影和定影。根据乳胶上出现的银粒在细胞中的位置，便可判断放射性物质（或由这种放射性物质

51、以及其他物质合成的化合物）在细胞内的分布.这种方法的基本过程是,先使细胞含有示踪原子的化合物，然后把这种组织细胞制成切片，使液体乳胶涂与其上，经过一定的时间暴光(即放射性物质放出的射线落在乳胶上使其溴化银还原而析出金属银,这个过程称为自选过程，亦称暴光),在进行显影和定影手续。根据乳胶上出显的银粒在细胞中的位置，便可判断放射性的物质（或由这种放射性物质以及它物质合成的化合物）在细胞内的分布. 自显过程的具体操作步骤是：(1)将染色或未染色的切片标本先覆盖一层明胶保护膜;(2)在暗室将凝胶壮液体加热融化，然后将盛乳胶的小杯放入40摄氏度的水浴锅中，再将切片浸入乳胶内片刻；(4)取出载片，立于染色

52、缸内自干,或揩去载片被面的乳胶，平放在温台内烘干;(5)将干燥的乳胶片放入暴光暗匣内,再4-10摄氏度低温下暴光;(6)显影 定影后，再用常规方法制片,最后用树胶封藏. 制备电子显微镜的放射自显影标本的程序是把用H等放射性同位素标记的化合物引入组织细胞,制成超薄切片,放在有支持膜(火棉胶加碳)的载网上，喷碳膜后再涂一薄层核乳胶。然后放在暗处暴光（暴光时间的长短视条件而不同,例如温度,切片中放射性物质的量和半衰期等，常要靠实践来确定,一般要几周乃至数月的时间）,暴光后进行显影 定影和冲洗.再经电子染色制成的标本即可在电镜下观察(图 )。 放射自显影术不但在定位研究上有灵敏度高，定位精确的特点，它

53、还是动态研究中最有效的手段。针对活细胞一般都采用放射自显影的追踪标记也称脉冲标记(pulsechase)的方法。这种方法是先用带同位素标记的前体分子掺入到生活细胞的代谢中去，标记一段时间后便把它彻底洗掉，再用不带标记的前体分子代替。然后在不同时间取样并分析同位素的量和它所在的位置，从而了解它们的代谢途径。许多生物大分子在细胞中的合成、修饰、排出、蓄积、更新等作用的机制和部位的研究结果都是利用脉冲标记的方法得到的.第三节 细胞培养和单克隆抗体技术一 细胞培养在细胞生物学及其它有关细胞的研究中，如何取得充足的高质量的细胞始终是一个需要解决的基本问题。特别是高等动物或人的细胞.从生物个体上取细胞不但

54、费用贵而且不方便。解决这 一问题的有效方法就是体外培养细胞。实际上人们早就开始了细胞的体外培养工作。1885年，德国学者Roux发现鸡胫细胞可在温热的生理盐水中存活一段时间，他称这项试验为 “explanation” ，即体外种植的意思。1907年美国动物学家Harrison从两栖类胚胎中取下一块神经管组织，放在一滴淋巴液中作悬滴培养，他观察到了神经管分化或神经元，并且向培养液中伸出了轴突。这些可以说是细胞培养的开拓性工作。从这些工作可以看出细胞培养(cell culture)是指将细胞从机体中分离出来，进行体外培养的技术。近年来，这项技术得到了很大的发展，许多动植物细胞都可以在人工配制的特定

55、的培养基中存活，有的培养细胞还可以分裂增殖甚至分化。目前细胞培养技术已在细胞生物学，分子生物学，遗传学，免疫学等许多领域中得到广泛的应用。1 动物细胞培养技术人们在研究细胞培养过程中发现，虽然动物细胞的种类繁多，性质各异，但它们在体外培养的生长方式上大致可分为二种类型.一类是贴壁依赖性细胞，大多数动物细胞都属这一类型.另一类型是非贴壁依赖性细胞，比如来源于血液，淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞属于这一类型。 (1)贴壁培养刚接种的细胞常成圆形并游离于培养液中，经数十分钟到数小时后细胞从游离期进入贴附期，细胞伸展并贴附于瓶壁。这叫细胞贴壁。圆形细胞一经贴壁就立刻铺展成多种形态并开始有丝分裂，细胞在分

56、裂过程中并没有停止移动，由于细胞数目不断增多，细胞间的距离也越来越小了。平展生长数天后就会形成致密的细胞单层.这时细胞彼此之间已经接触，这使细胞的运动受到抑制，这种现象叫接触抑制(Contact inhibition)。然而接触抑制实际上只抑制了细胞的运动而并没有抑制细胞的分裂。所以我们看到细胞长满生存平面后仍能继续分裂，直到细胞达到一定密度，才停止分裂。这后一种抑制叫密度抑制（Density inhibition）。这时如果要细胞继续分裂增殖就要进行及时的分散，分瓶接种于新鲜培养基中继续培养。这一过程叫传代培养（Subculture）。这种直接从有机体取出的细胞培养至第一次传代为止，称原代细胞培养。原代培养的细胞一般传到10代左右，大部份细胞才会进入退化期，出现细胞的大量死亡。有人据此而把培养10代以前的细胞统称为原代细胞培养。经过10代培养的细胞仍有极少数存活下来，这些细胞往往会继续顺利传代4050次。虽然这些细胞的形态有了很大的变化，但它们仍保持着染色体的2倍体数量和接触抑制的行为。多数学者把这种传代细胞称为细胞株（Cell strain）。经过50次左右传代的细胞，已不能