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文档简介
1、 1 生化反响曲线生化反响曲线 2生化分析根本原理生化分析根本原理 生化反响曲线生化反响曲线内容概略内容概略 3罗氏生化分析系统产品线罗氏生化分析系统产品线Cobas 6000 (c501) 600T/HModular D 2400T/HModular P 800T/HCobas c311300T/HCobas c111180T/HCobas 8000 2000T/H 4cobas 8000 cobas 8000 模块化组合分析系统模块化组合分析系统 智能、高效、智能、高效、强劲强劲 5物质对光吸收的根本定律物质对光吸收的根本定律 Lambert- Beer Lambert- Beer定定律律
2、 LambertBeer定律表达为: 当一束平行的单色光经过含有均匀吸光物质的溶液时,溶液的吸光度(A)与溶液的浓度(C)和光透过液层厚度(L)的乘积成正比。物质对光吸收的吸光系数e为常数。 其数学表达式:A = e*C*L I入射光透射光I0= = =-光吸收的根本定律光吸收的根本定律= =light detector 6根据根据Lambert- BeerLambert- Beer定律来计算待测物浓度定律来计算待测物浓度如假设吸光系数如假设吸光系数 ( ) ( )未知,我们就需求采用定标曲线未知,我们就需求采用定标曲线 来计算待测物的来计算待测物的浓度。浓度。 浓度 (amount of s
3、ubstance)吸光度 (amount of color)40123456706050302010Calibrator/standard 规范品 (cfas)待测样本Concx = Absx x ConcsConcx = Absx x Concs AbssAbssConcx Concx = = 待测样本浓度待测样本浓度Concs Concs = = 规范品浓度规范品浓度 Absx Absx = = 样本吸光样本吸光度度Abss Abss = = 规范品吸光度规范品吸光度此值为定值 7 Lambert-Beer 定律 适宜于任何均匀非散射的介质 生化比色分析特定蛋白透射比浊分析Lambert-
4、Beer 定律分光光度法定量分析的根据分光光度法定量分析的根据 8Roche Hitachi PhotometerRoche Hitachi Photometer 9 当相应的比色杯每一次经过光路系统时,光路系统会丈量并记录下相应的吸光度光路系统可以丈量后分光后12个波长的相应吸光度。12 有效波长: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm 多数检测工程都运用双波长检测方法。可去除干扰物对检测结果的影响Reaction sequenceReaction sequence 10 11 12仪器读数的原理不同仪器每个
5、循环周期的时间间隔Modular P 18秒Cobas c702 16秒Cobas C501 8秒Modular D 12秒C311 12秒反响转盘不停的周期旋转当相应的比色杯经过光路系统时,光路系统会丈量并记录下相应的吸光度在不同的时间点参与相应的反响试剂 13Reaction sequenceReaction sequence 14Instrument cycleInstrument cycle 15Endpoint and rate (kinetic) assaysEndpoint and rate (kinetic) assays自动生化分析常用的方法有自动生化分析常用的方法有: :
6、终点法终点法End Point AssaysEnd Point Assays:普通在整个反响完成后再来检测吸光度:普通在整个反响完成后再来检测吸光度 速率法速率法Rate assaysRate assays :普通在反响的过程中监测吸光度的变化情况:普通在反响的过程中监测吸光度的变化情况 16终点分析法终点分析法时间吸光度A 1tS+R1 基于基于 被测物质在反响过程中到达反响终点或平衡点,根据该被测物质在反响过程中到达反响终点或平衡点,根据该点吸光度的大小求出被测物浓度,称为终点法。点吸光度的大小求出被测物浓度,称为终点法。 终点法的计算:终点法的计算: 从时间从时间- -吸光度曲线来看,吸
7、光度曲线来看,到达反响终点时,吸光度将不再到达反响终点时,吸光度将不再变化。在到达终点时任取一点进变化。在到达终点时任取一点进展测定,此时底物和产物的量都展测定,此时底物和产物的量都不再变化。不再变化。吸光度A 1S+R1吸光度 17 两点终点法两点终点法2-point end2-point end 一点终点法一点终点法 1-point end1-point end 一点终点单试剂一点终点单试剂1-point endpoint assay one reagent1-point endpoint assay one reagent 一点终点双试剂一点终点双试剂1-point endpoint a
8、ssay two reagents1-point endpoint assay two reagents 三点终点法三点终点法3-point end3-point end终点分析法终点分析法Endpoint assaysEndpoint assays 18两点终点法两点终点法 在被测物反响或指示反响尚未开场时,选择第一在被测物反响或指示反响尚未开场时,选择第一个吸光度,在反响到达终点或平衡时选择第二个吸光度,个吸光度,在反响到达终点或平衡时选择第二个吸光度,此两点吸光度之差用于计算结果。此两点吸光度之差用于计算结果。 19去除了样本的本底采用两个丈量点 针对两个或多个试剂的工程第一个读数点普通
9、选在添加最后一个试剂之前第二个读数点普通选在参与最后一个试剂之后且曾经到达了反响终点两点终点法的特点两点终点法的特点C + D (显色产物)+ B1 (试剂1) + B2 (试剂 2)A (A (样本样本) )Endpoint assaysEndpoint assays 20两点终点法的反响曲线两点终点法的反响曲线Cobas c702Cobas c702Endpoint assaysEndpoint assaysSample+R1Mp1 abs before addition of R3Mp2 abs at reaction end 21两点读数的时间点:第19点丈量包含了样本和试剂1的本底
10、sample + reagent 1 第 38点在参与一切试剂后,反响到达终点 sample + reagent 1+ reagent 2两点终点法的运用参数两点终点法的运用参数 Cobas c702 Cobas c702丈量的两个读数点方法类型总反响时间min2Point Endpoint assay application settings2Point Endpoint assay application settings 22RF-II C4 C3 ASL CRPL IGG IGA IGM两点终点法分析工程举例两点终点法分析工程举例Endpoint assaysEndpoint assa
11、ys 23一点终点法一点终点法A单试剂一点终点法例如:CHOL/TG. 在反响到达终点,即在时间在反响到达终点,即在时间- -吸光度曲线上吸光度不再吸光度曲线上吸光度不再改动时选择一个终点吸光度值,用于计算结果。改动时选择一个终点吸光度值,用于计算结果。B双试剂一点终点法Mg(双试剂) 24单试剂一点终点法的特点单试剂一点终点法的特点1-point endpoint assay one reagent1-point endpoint assay one reagent不包含样本的本底不包含样本的本底仅进展一个点的丈量仅进展一个点的丈量检测工程举例:甘油三酯检测工程举例:甘油三酯TGTGEndp
12、oint assaysEndpoint assaysA (样本) C + D (显色产物)+ B (试剂) 25单试剂一点终点法的反响曲线单试剂一点终点法的反响曲线1-point endpoint assay one reagents1-point endpoint assay one reagentsEndpoint assaysEndpoint assays 26 不包含样本的本底 仅进展一点丈量 运用工程举例: Magnesium 不采用两点终点法主要是样本和R1体积相加仍180uL(最小反响体积,无法丈量双试剂一点终点法的特点双试剂一点终点法的特点1-point endpoint as
13、say two reagents1-point endpoint assay two reagentsC + D (product)+ B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)A (sample)A (sample) 271st entry: 方法类型2nd entry:总分析时间3rd - 6th entry:丈量点 一点终点法运用参数一点终点法运用参数1 Point Endpoint assay1 Point Endpoint assayUtility - Application - AnalyzeUtility - Application - Analyze 28
14、TRIGL CHO 一点终点法分析工程举例一点终点法分析工程举例Endpoint assaysEndpoint assays 29例如例如, ,多项同测组合试剂盒多项同测组合试剂盒,CHO,CHO与与TGTG同一测定同一测定 即双终点法即双终点法, ,在一个通道内一次进展两项反响相关在一个通道内一次进展两项反响相关的终点法测定的终点法测定. .三点终点法三点终点法 30上升 increasing 或 下降decreasing终点法反响的方向终点法反响的方向Reaction DirectionReaction Direction 31 速率法速率法 吸光度tt2t1t3 t4A1A2A3S+R时
15、间A 1 利用线性反响期,计算出单位时间的吸光度变化A/min,来计算酶的活性。单位时间的吸光度变化量是一致的 在酶促反响过程中在酶促反响过程中, ,在反响速度恒定期在反响速度恒定期( (线性反响期线性反响期) )来延续察看和记录一定来延续察看和记录一定反响时间内底物或代谢产物变化速度的化学方法反响时间内底物或代谢产物变化速度的化学方法. . 32速率速率A A法法 Rate ARate A两点速率法两点速率法2-point Rate2-point Rate速率法速率法Endpoint assaysEndpoint assays 33 速率速率A A法法A 单试剂速率法例如:ACPAFUB 双
16、试剂速率法 例如:ALTASTCK 在较长的反响时间区段内,每隔一定时间读取一次吸光度值,至少读取4点,得到3个A,求出单位时间的反响速率 A/min .经过最小二乘法least squares method 34Rate A assay Modular PRate A assay Modular PReag. at R3 timingLast mp1st. mpSample Reag. at R1 timingRate assaysRate assays 35GOT/ASTGGTGPT/ ALT LipaseALPGLDHAmylaseLDHCHECKMB 速率速率A A 法法- -分析工程
17、举例分析工程举例EnzymesRate assaysRate assays 36 2 2点速率法点速率法 2点速率法尿素氮 指在时间指在时间- -吸光度曲线上选择两个测光点,此两点既非反响初始吸光吸光度曲线上选择两个测光点,此两点既非反响初始吸光度亦度亦非终点吸光度,这两点的单位时间吸光度差值用于结果计算。非终点吸光度,这两点的单位时间吸光度差值用于结果计算。 372-point Rate assay2-point Rate assayRate assaysRate assaysC + D (product)+ B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)A (sample)
18、A (sample)Enzyme 38采用一种或多种试剂检测两个丈量点检测固定的间隔时间内两点的吸光度变化。 换算成 Abs/min参与计算在参与最后最后一个试剂之后进展吸光度检测。两点速率法的特点两点速率法的特点2-point Rate assay2-point Rate assayRate assaysRate assays 392-point Rate assay Modular P2-point Rate assay Modular PRate assaysRate assays 40AmmoniaAcid phosphataseNon-prostatic phosphataseUrinary/CSF protein BicarbonateUreaRate assaysRate assays2 2点速率点速率 法法- -分析工程举例分析工程举例 41Reaction DirectionReaction Direction上升decreasing 或 下降increasing 生化反响曲线生化反响曲线 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57Thank you for your att
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