实验一DNA提取

1、植物植物DNADNA的提取与纯化的提取与纯化 DNA extraction实验一实验一实验原理实验原理植物植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求：提取一般有三个要求：1. DNA的纯度可以满足下游操作的要求的纯度可以满足下游操作的要求2. DNA必须完整必须完整3. DNA应当有足够的量应当有足够的量一般来说一般来说,构建基因组文库构建基因组文库, 初始初始DNA长度必须在长度必须在100kb以上以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行否则酶切后两边都带合适末端

2、的有效片段很少。而进行RFLP和和PCR分析分析, DNA长度可短至长度可短至50kb，在该长度以上，在该长度以上，可保证酶切后产生可保证酶切后产生RFLP片段片段(20kb以下以下)，并可保证包含，并可保证包含PCR所扩增的片段所扩增的片段(一般一般2kb以下以下)。如果对植物进行大规模筛选，操作程序应当快捷，简便，价如果对植物进行大规模筛选，操作程序应当快捷，简便，价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。n脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)、核糖核酸、核糖核酸(RNA)(RNA) n与蛋白质结合在一起以核蛋白（与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNPDNP

3、）的形式存在。）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。白释放出来。n植物总植物总DNADNA包括细胞核包括细胞核DNADNA和细胞核外和细胞核外DNA,DNA,前者存前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)DNA(mtDNA)和和叶绿体叶绿体DNA(ctDNA)DNA(ctDNA)。核酸的存在形式核酸的存在形式核酸的理化性质核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，和核苷酸的纯品都呈白

4、色粉末或结晶，DNA则为白色类则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为在水中为10g/L，呈，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性易水解，在中性或弱碱性溶液中较

5、稳定。或弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核形式存在于细胞核中。要从细胞中提取中。要从细胞中提取DNA时，先把时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离及无机离子等，从中分离DNA 。 提取植物提取植物DNA的方法主要采用的方法主要采用SDS和和CTAB法，对它们进行稍法，对它们进行稍加修改就可以应用于加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解

6、。不受内源核酸内切酶降解。具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制抑制DNA酶的活性。再用酚、酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。溶液经乙醇沉淀。 机械方法：机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用化学试剂法：用SDSSDS处理细胞；处理细胞； 酶解法：

7、酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 细胞破碎细胞破碎 SDSSDS法法 SDSSDS是有效的阴离子去垢剂是有效的阴离子去垢剂, , 细胞中细胞中DNADNA与蛋白与蛋白质之间质之间 常借静电引力或配位键结合常借静电引力或配位键结合, , SDSSDS能够破坏能够破坏这种价键。这种价键。CTABCTAB法法 CTABCTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的脂膜，使细胞中的DNA-DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使蛋白质变性，使DNADNA与蛋白质分离。与蛋白质分离。

8、DNADNA提取提取实验材料和试剂实验材料和试剂实验材料：新鲜植物组织。实验材料：新鲜植物组织。100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)50mmol/L EDTA500 mmol/L NaCl1.5% SDSDNA提取缓冲液提取缓冲液实验所需试剂：实验所需试剂：24:1/氯仿氯仿:戊醇戊醇其它试剂：液氮、其它试剂：液氮、TE缓冲液，无缓冲液，无水乙醇、水乙醇、70%乙醇。乙醇。2CTAB buffer 100mM Tris pH8.0 1.4M NaCl 20 mM EDTA pH8.0 2% CTAB 0.2% 巯基乙醇巯基乙醇酚酚/氯仿（氯仿（1:1） 氯仿：氯仿：50 ml

9、无水乙醇无水乙醇蛋白质蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（常用苯酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）或）或氯仿：异戊醇（氯仿：异戊醇（2424：1 1）抽提。）抽提。RNA RNA 常选用常选用RNaseRNase消化消化 ，或是用，或是用LiClLiCl来消除大分子来消除大分子的的RNARNA。酚类物质酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。材料。多糖提取液中加多糖提取液中加1 1PVPPVP。DNADNA纯化（去杂质）纯化（去杂质） PVP（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的离子化。2-巯基乙醇作为还原剂可以防止酚类的氧化。适用于提取新鲜植

10、物以及干品、冷冻品的基因组DNA。实验仪器实验仪器实验步骤：实验步骤：1. 取新鲜叶片约取新鲜叶片约3g, 剪碎剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中；离心管中；2. 在在65预热的提取液中按预热的提取液中按3.8g/L加入加入Na Bisufite, 混匀并调混匀并调pH至至8.0；3. 在管中加入适量提取液，在管中加入适量提取液，60水浴保温约水浴保温约30min，不时颠倒混匀；，不时颠倒混匀； 4. 冷却至室温后加入等体积氯仿冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动15min左右；左右；5. 室温下室

11、温下10000rpm离心离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精，积的冷酒精，-20 放置放置1h或过夜；或过夜；6. 挑出挑出DNA置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量适量70%酒精，摇动洗涤酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤，重复洗涤2-3次；次； 7. 吹干吹干DNA，加入适量，加入适量TE在在65溶解，完全溶解后离心去除杂质；溶解，完全溶解后离心去除杂质； 8. 加入加入RNase（10mg/mL）, 室温处理室温处理0.5-1h, 除去除去RNA，4

12、或或-20贮存。贮存。 9. 如需纯化如需纯化DNA，再加入适量，再加入适量TE，氯仿，氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清，加异戊醇多次抽提后吸取上清，加入入3ml/L NaAc和两倍体积的乙醇，和两倍体积的乙醇， -20 放置放置1h或过夜；或过夜；10.吹干沉淀后，加入适量吹干沉淀后，加入适量TE， 65溶解，溶解， 4或或-20贮存。贮存。 1. 植物叶子约植物叶子约3g, 剪碎置剪碎置预冷预冷研钵中研钵中 加入液氮充分研磨，加入液氮充分研磨，注意不能干磨注意不能干磨3. 3. 60水浴保温水浴保温30-60min加入等体积氯仿，用力摇匀加入等体积氯仿，用力摇匀6. 6. 再次再次10000rpm离心离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中；将上清小心吸入新的离心管中； DNA样品在样品在0.9% Agarose胶上电泳（例图）胶上电泳（例图） 实验注意事项实验注意事项1.微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；2.提取过程中的机械力可能使大分子提取过程中的机械