bcl2基因转染对人胃上皮细胞GES(一)(精)

1、bcl2基因转染对人胃上皮细胞 GES一） 作者：朱丽华，李淑英， 周洪霞，习瑾昆，章广玲，周天戟 【关键词】bcl2 基因 【Abstract 】 AIM : To observe the effect of bcl2 gene transfection on the proliferation of human gastric epithelial cell GES1. METHODS : The eukaryotic vector carry ing the full le ngth of bcl2 gene and the n eomyc in resista nee gene (pc

2、DNA3/bcl2) and the one only carry ing the n eomyc in resista nee gene (pcDNA3) were amplified and purified. The plasmid of pcDNA3/bcl2 was used to tran sfect GES1 cells by using the lipofectami ne, and the empty vector pcDNA3 to tran sfect GES1 cells as con trols. And the n, the cells were cultured

3、in 1640 culture medium containing an appropriate concen trati on of G418 for selectio n. The method of HRP label immuno histochemical sta ining was used to ide ntify the cells express ing bcl2 gene positively. The morphologic cha nges of GES1 cells were observed un der an optical microscope by HE st

4、a ining. The cell proliferati on affected by the tran sfecti on of bcl2 was measured by cell coun ti ng and MTT assay. RESULTS: bcl2 gene and the vector pcDNA3 were tran sfected separately into GES1 cells by lipofectami ne. After G418 selectio n, the cells were tran sfected steadily. Compared with c

5、on trols, HRP label immuno histochemical stai ning showed that bcl2 gene tran sfected cells expressed Bcl2 prote in much more obviously. No morphologic cha nges were observed by HE sta ining. The growth curve was draw n by the method of cell counting ，which showed that the growth of bcl2 gene transf

6、ected cells was faster tha n that of empty vector tran sfected cells and untran sfected cells after 6 d culture. And MTT assay showed that the growth of bcl2 gene transfected cells were 4.15 0.31，5.98 0.56 and 8.94 0.79, respectively. While MTT assay showed that the growth of control cells were 3.01

7、 0.20， 4.76 0.52 and 7.69 0.84, respectively. Sign ifica nt differe nces were found betwee n the 2 groups (P0.05). CONCLUSION: The tran sfected of bcl2 gene makes the cells express Bcl2 protein steadily and highly, and enhan ces the cells proliferati on and malig nancy. 【Keywords bcl2 gene; transfec

8、tion; gastric mucosa; epithelial cell; GES1; proliferati on 【摘要】 目的：观察 bcl2 基因脂质体法转染人胃上皮细胞系 GES1 及其转染后 对GES1 细胞增殖的影响.方法：以脂质体法转染构成 bcl2 基因表达的人胃上 皮细胞系 GES1 细胞模型， 空载体质粒 pcDNA3 专染 GES1 细胞及正常 GES1 细胞 为对照；经酶标免疫组织化学法鉴定 bcl2 基因表达阳性细胞；用 HE 染色法进 行形态学观察；并采用细胞计数及 MTT 法分析 bcl2 转染后对 GES1 细胞增殖的 影响结果：脂质体法转染 bcl2 基因

9、后，细胞高表达 Bcl2 蛋白；HE 染色后形 态学观察无明显改变；细胞计数法绘制细胞生长曲线结果显示 bcl2 基因转染 6 d 后细胞生长速度明显超过对照组， MTT 法结果显示 bcl2 基因转染第 24,48,72 h，A490 nm 值分别为 4.15 0.31，5.98 0.56，8.94 0.79，对照组分别为 3.01 0.20，4.76 0.52，7.69 0.84，两组相比较具有显著性差异 （P0.05）. 结论：bcl2 基因转染使 GES1 细胞稳定且高表达 Bcl2 蛋白，并促进了细胞增殖 【关键词】bcl2 基因；转染；胃黏膜；上皮细胞； GES1 增殖 0 引言

10、胃癌的发生是一个多因素、多阶段的发展过程 .bcl2 是近年发现的细胞凋亡调 控基因，其异常表达与胃癌、宫颈癌、胃肠道等肿瘤发生发展尤为密切 1-3 我们探讨 bcl2 基因在人胃上皮细胞系 GES1 中的表达情况，探讨该基因表达量 与人胃上皮细胞生长特性之间的关系如下. 1 材料和方法 1.1 材料正常人胃上皮细胞系 GES1 本室保存；质粒 pcDNA3 由日本北海道大学 医学部遗传医学研究所肿瘤病毒学部门高田贤藏教授惠赠； Lipofectamine、 DME 培养液、RPMI 1640 培养液、MTT 胎牛血清购于 Gibco 公司；小鼠抗 Bcl2 （一抗） 、 HRP 标记山羊抗小

11、鼠 IgG （二抗） 购于北京华美生物制品公司； Olympus光学显微镜为日本 Nik on 公司产品. 1.2 方法细胞稳定转染参照 Lipofectamine 4转染说明书进行，基因转染 48 h 后，换用含 300 mg/L G418 的完全培养基筛选.取待染细胞爬片， 固定， 滴 加 30 mL/L H2O2,室温孵育 15 min，滴加 1 : 100 稀释的小鼠抗 Bcl2 mAb， 4C湿盒中过夜，PBS 洗，滴加山羊抗小鼠 IgG HRP 结合物， 37C,孵育 30 min, PBS 洗涤， DAB 容液显色 5 min，PBS 终止反应；自来水充分冲洗，系列 乙醇脱水，二

12、甲苯使其透明，中性树胶封片，检测转染细胞中 Bcl2 蛋白的表达. 转染 bcl2 的 GES1 细胞经 HE 染色进行形态学观察并照相.另接种细胞于 24 孔 培养板中，每孔接种 3X106/L.每天取 3 个孔计数，测出每孔中的细胞总数， 求出每组平均值，持续计数 10 d,绘制生长曲线.细胞接种于 96 孔培养板 中，培养 24,48,72 h 后每孔加入MTT 溶液（5 g/L ） 20 卩 L，37C，继续孵育 4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液.每孔加入 DMSO 150 卩 L,振荡 10 min,使结晶物充分溶解.选择 490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各 A 值

13、，记录结果.空载体质粒 pcDNA3 专染 GES1 细胞及正常GES1 细胞为对照. 统计学处理：实验结果以 x s表示，用 SPSS 11.5 软件包进行统计分析，组间 比较用单因素方差分析，两两比较使用 Dunnettt 检验. 2 结果 2.1 转染细胞中 Bcl2 蛋白表达与对照组(GES1 和 GESI/PcDNA 组)比较，免疫组 织化学染色法显示 bcl2 基因转染细胞均有 Bcl2 蛋白表达，且明显高于对照组 (图 1).另经 HE 染色，光镜观察，bcl2 基因稳定转染细胞后，细胞形态未见 改变 2.2 细胞生长速度绘制生长曲线结果表明 bcl2 基因转染细胞于第 4 日后

14、生长速 度明显高于对照组(图 2).培养 24,48 和 72 h 转染组细胞的增殖明显增高， 经统计学分析，转染组和对照组相比较，有统计学差异( P0.05,表 1).表 1bcl2 基因转染后细胞的增殖(略) 3 讨论 Bcl2 高表达是对各种凋亡刺激的保护，因此 Bcl2 低表达或缺失的细胞死亡率 明显增加.bcl2 基因被证明在抑制细胞向凋亡的转变中起重要作用 ，可以抵抗 和抑制多种因素诱导的细胞凋亡，增强细胞的存活力，参与细胞增殖与凋亡动 态平衡的调控 5-6:.转染 bcl2 基因可抑制化疗药物、 加热、 放射线、 细胞 生长因子撤销、 cmyc或 p53 基因等多种因素诱导的多种

15、细胞的凋亡，延长细胞 生存时间7-8.我们用脂质体介导的基因转染法，将含有人 bcl2cDNA 的真 核表达载体 pcDNA3 导入人胃上皮细胞系 GES1 成功地建立了 100%稳定表达 Bcl2 蛋白的 GES1bcl2. 【参考文献】 1史朝晖,姜希宏,靳文武,等抑凋亡基因 bclx L 在胰腺癌组织中的表达 及意义J山东医药,2003,43 (36) :9-10. 2夏克栋，陈向敏，林巧爱，等.NFKb、IKb、Bcl2 在宫颈癌组织中的表 达及其与人乳头瘤病毒感染的关系J癌症,2005,24 (11) :1350-1353. 3孙梅，张兴义，邹洪杰，等.CyclinD1、Ki67 和 Bcl2 在胃肠道间质瘤 的表达及与其预后的关系J中华胃肠外科杂志,2005,8 (6) :542-543. 4王贤辉，梁米芳，李德新，等.鼠 bclX_L 基因在 CHO胞中的表达 J.第四军医大学学报,2003,24 (24) :2217-2219. 5李俊峡，贾国良，金明，等.转染 bcl2 基因对心肌细胞活力的影响 J.第四军医大学学报,2003,24 (2) :110-112. 6王长洪，陆宇平，冯新莉，等.黄苔胃病患者胃黏膜凋亡基因及相关蛋 白的表达J中国中西医结合消化杂志,2004,12 (1):13-