难治性癫痫动物模型研究进展

1、难治性癫痫动物模型研究进展【摘要】 癫痫动物模型种类繁多，有电刺激点燃模型，化学点燃模型和遗传癫 痫模型等多种癫痫模型，大部分可以制备为难治性癫痫模型， 对难治性癫痫的研 究和治疗药物筛选提供了有力工具；现对不同癫痫模型的制作方法、症状表现和 发病机制等方面进行综述。【关键词】 难治性癫痫；动物模型；进展癫痫(epilepsy)是最常见的神经系统疾病之一，其中70%80%患者经系统应用抗癫痫药治疗可获得长期缓解，其余20%30%患者的发作不能得到有效 控制，成为难治性癫痫(refractory epilepsy) 1。困难治性癫痫长期反复发作， 不仅使患者遭受到躯体痛苦，而且在一定程度上可导致

2、患者心理障碍及引起一系 列社会问题2,因此成为目前癫痫研究的难点和重点。动物模型可筛选出难治 性癫痫和药物有效癫痫，克服人体研究的缺陷，可用于难治性癫痫发生机制的研 究，进而寻找到更加有效的治疗方法3。目前主要通过建立难治性癫痫动物模 型探讨其发病机理、耐药机制以及筛选鉴定新的抗癫痫药。难治性癫痫动物模型 建立的国际标准：一线的抗癫痫药物不能控制其癫痫发作； 模型发作时有脑 部异常放电，可从电生理角度评价药物疗效； 发作类型应与临床类型相似，即 复杂部分性发作继发全身性发作； 能够长期存活，可进行抗癫痫药物的长期研 究。现对不同癫痫模型的制作方法、症状表现和发病机制等方面进行综述。1遗传性癫痫

3、动物模型遗传性癫痫动物痫性发作很接近于人类癫痫行为、电生理和生化改变。有的 动物本身具有先天癫痫易感性，有的是通过基因打靶制成的转基因癫痫模型或是 通过理化和放射线制成皮层发育畸形模型使其对癫痫易感。遗传模型包括光敏感 狒狒、光敏感家禽、遗传癫痫易感大鼠 (genetically epilepsy prone ra,t GEPR)和 DBA/2 鼠、蒙古沙土鼠(meriones unguiculatus蹒跚小鼠(tg/tg strain)和癫痫狗。 在光的刺激下，光敏感狒狒会出现面部、颈项、四肢肌肉的反射性阵挛继之以全 身强直阵挛大发作。但这种痫性发作能被临床常用的抗癫痫药物如镇静安眠剂及 苯

4、二氮卓类药物所阻断。家禽(雏鸡)的发作易感性是由于纯合子常染色体隐性遗 传特点引起，其自发性发作在胚胎期及此后一生中持续发作。 14次/s的闪光刺激 可以引起癫痫发作，主要有头颈部肌肉痉挛、腿部肌张力消失，最后是振翅拍打 和阵挛性腿抽动；发作期间的 EEG表现为高频低幅放电，强声刺激会引起光敏 感家禽疯狂奔跑。遗传性癫痫易感大鼠又分为GEPR-3和GEPR-9两系，它们有不同的癫痫易患体质。相同的刺激GEPR-3亚群表现为单一的奔跑继之出现全身 阵挛；而GEPR-9亚群却诱导出严重的强直阵挛发作。与人类癫痫发作相似的是， GEPR-9亚群在多次发作之后其强直期和阵挛期的会逐渐加强。有研究表明脑

5、干 和下丘脑与这种癫痫的发作产生有密切关系，提示人们应该把皮层下结构作为研 究癫痫机制和治疗癫痫的一个靶点4 , GEPR-3和GEPR-9大鼠对部分抗癫痫药 物有效。基因敲除和转基因癫痫模型是利用基因打靶可以建立人类遗传性癫痫的动 物模型，即在培养的胚胎干细胞进行打靶可以诱导突变使突变的靶基因在动物身上得以遗传。理论上凡是在癫痫发作中神经元兴奋性增强、 抑制性减弱的物质和 结构其基因均可作为研究的候选靶点。基因敲除和转基因癫痫模型具有能研究癫 痫相关基因相互作用的优势，这是其他种类模型所不具备的；但每种基因的表达 和其所处的基因背景是相关的，很多文献也指出敲除或植入的基因在不同的载体 基因背

6、景下有不同的表型5。2点燃模型目前，应用最广泛的癫痫模型为点燃模型，具发病机制被认为与人类癫痫的 发病机制相似。根据刺激方法，点燃模型主要有电点燃和化学点燃。点燃不仅可 进行性提高发作敏感性，还可以引起脑功能改变，是现在公认的难治性癫痫的理 想模型。根据点燃的刺激方法可将其分为电点燃和化学点燃。根据点燃的速度可 分为慢性点燃和快速点燃。其中经杏仁核慢性电点燃和海人酸化学点燃模型是目 前研究难治性癫痫较理想的动物模型。2. 1电点燃模型电点燃是以同等强度的阈下刺激，在一定的时间问隔下重复刺激动物边缘脑 区的某一部位，使癫痫活性强度逐渐增加，最终出现全面性癫痫发作。电刺激脑 许多部位可以引起点燃，

7、杏仁核、苍白球、梨状皮质、嗅区、前新皮质、鼻内侧 皮质、嗅球、隔区、视前区、尾壳核和海马等部位进行电刺激都可以引起点燃， 但杏仁核是最容易引起点燃的结构6,由于对电刺激最敏感，目前用于难治性癫 痫研究的主要有杏仁核点燃模型。杏仁核电点燃模型制作时，首先将大鼠麻醉固定在脑立体定位仪上，确定大鼠杏仁核位置，然后用注射针头穿透骨面，插入直径为0.25 mm的绝缘双极电极， 尖端分开约0.25 mm,将电极用牙托粉及502胶水固定在颅骨表面，缝合头皮。 术后10 d开始点燃实验7。采用电子刺激器输出周期1 s,波宽1 ms,频率50 Hz 的恒流电脉冲，生物机能实验记录仪记录大鼠电活动，刺激强度由20

8、 nA开始， 每次增加20%,刺激间隔1 min,直至出现3 s或3 s以上的皮层电流即脑电图上 出现棘尖或棘慢波，此时电流强度即为后放电阈值( ADT)。ADT确定5 min后 给大鼠阈上刺激，双相方波，刺激参数：强度400 nA,波宽1 ms,频率60 Hz, 持续时间1 s,刺激间隔时间7 min ,直至出现Racine IVV级行为，即点燃， 之后每天如此。点燃动物连续出现10次大发作后24 h测定点燃后ADT。对照大 鼠ADT确定后24 h,实验大鼠局部或全身给予抗癫痫药，于最后一次用药后测 定ADT ,此为用药后ADT值。当与对照ADT比较，给药后ADT增加20%为药 物有效癫痫；

9、与对照ADT比较，给药后ADT不增加或增加20%为难治性癫痫。 杏仁核电点燃模型的发作类型为复杂局灶发作继发全面发作，已广泛用于难治性癫痫发生机制的研究及治疗方案的筛选8。2. 2化学点燃模型化学点燃是反复给予低于抽搐剂量的药物诱发逐渐加重的癫痫发作，用在脑内或全身性注射进行点燃的有海人酸(kainic acid,KA)、青霉素、戊四氮、美解眠、匹鲁卡品等。海人酸（kainic acid,KA）是谷氨酸的结构类似物，其神经兴奋作用比 谷氨酸强30100倍。KA点燃的复杂部分发作模型是一种较理想的难治性癫痫 动物模型。海人酸制作大鼠癫痫模型，具给药方式有两种。一种是局部给药，包 括脑室内给药（剂

10、量为0. 41. 5 ug/kg）和脑内局部注射（海马、杏仁核、梨状叶或 纹状体等）给药侪I量为0. 82. 0 ug/kg）;另一种是全身给药、皮下、静脉或腹腔 内注射（剂量为412 mg/kg）。不同的大鼠模型对海人酸的反应存在种属和个体的 差异，W istar大鼠对海人酸的敏感性要强于 SD大鼠；老龄大鼠要敏感于年轻的 大鼠。全身或局部给药2030 min,动物出现凝视、点头和湿狗样抖动（wetdogshakes）持续约30 min。于0. 52. 0 min,出现反复发作的咀嚼、面部抽搐、上肢 抖动、后退、站立跌倒和旋转等，发作问期渐短，发作期渐长；约2 h后动物出现 反复自发癫痫发作

11、（癫痫持续状态），4 h后逐渐减弱，8 h后完全缓解。也可以应用亚抽搐剂量戊四氮建立慢性点燃动物模型（该点燃模型发作时为 复杂部分性发作伴继发全身性发作）；后给予较大剂量的一线的抗癫痫药物不规 则给药进行诱导，最后制成难治性癫痈的动物模型。随着应用AED的剂量增加，耐药大鼠数量显著增加。这提示不规则应用大剂量抗癫痈药物可能导致难治性癫 痈的发生。另外，韦云飞9等采用苯巴比妥钠对37只杏仁核成功点燃大鼠进行筛选。 根据后放电阈值（after discharge thershold,ADT）的变化判断点燃大鼠对 PB的敏感 及耐药情况，并测定大鼠不同区域脑组织P-糖蛋白（P-glycoprotei

12、n, PGP）的表达。 结果证明用PB对杏仁核点燃大鼠进行耐药筛选以制备难治性癫痫大鼠动物模型 进行难治性癫痫领域的研究也是可行的。3点燃模型优缺点电点燃杏仁核引起的自发性边缘系统癫痫与人类颍叶癫痫在症状学、神经病理学和行为学缺陷等方面均很相似，并且模型稳定性好 ，致痫效应相对持久，点 燃状态一旦形成可以持续至少数月，继续刺激还可形成自发性癫痫，重复诱发率 高发作行为可控性好，诱发需要的刺激次数、行为级数、后放电阈值、后放电 时程等均可作为定量研究的依据，是一种较理想的IE动物模型。但缺点主要是制 作复杂、动物不易饲养、容易死亡等。海人酸模型制作比较简单，发作时与人类颍叶癫痫的行为特点相似，

13、神经病 理学研究上发现模型的神经元丢失、胶质细胞增生、苔薛纤维丝状芽生等与人类 颍叶癫痫相似，海人酸模型对大部分抗癫痫药物耐药， 已广泛应用于难治性癫痫 耐药机制的研究中，但海人酸模型对癫痫灶的控制及预测癫痫发作较电刺激模型 差，在难治性癫痫研究中有一定限制。4点燃模型的致痫机制4.1 分子生物学机制 兴奋性增高：谷氨酸释放增加及转运减少，海马神经 元兴奋性氨基酸受体（NMDAR）上调10;训制性降低：谷氨酸脱竣酶在海马和 杏仁核显著减少及抑制性的乙酰胆碱（GABA）能神经元的兴奋作用减弱；反复电刺激使脑内抑制性神经递质去甲肾上腺素耗尽，研究 11表明中枢肾上腺素受体 参与杏仁核点燃过程；离子

14、失平衡：NMDA调控离子通道发生Ca2+大量内流， 当能量耗竭或细胞内环境紊乱后， 细胞即凋亡，神经元受损点燃。回返性兴奋 性环路形成：苔薛纤维发芽是癫痫动物海马的病理改变之一，其芽生侧枝会回返进入大脑皮质颗粒层支配颗粒细胞， 形成回返性兴奋性环路，使痫性放电和痫性 行为逐渐强化，最后出现癫痫大发作。如急性杏仁核点燃模型动物大脑已证实有 苔薛纤维发芽12,可能是该类模型的致痫机制之一。4.2 病理生理机制海马苔葬纤维发芽引起突触重组导致海马回返性兴奋性环路形成，痫性放电和痫性行为逐渐强化，最后出现大发作而点燃。在电镜下急 性杏仁核点燃已证实有苔葬纤维发芽，而经典慢性杏仁核点燃尚未发现13。电生

15、理机制与增强效应和爆发性棘波(树突膜高电压依赖性Ca2+内流产生)有关。5点燃模型成功评判标准动物痫性行为级数按Racines分级14 ： 0级：正常；1级：湿狗样颤动，面 肌痉挛，如眨眼、动须、节律性咀嚼等；2级：节律性点头；3级：前肢痉挛； 4级：站立伴双侧前肢痉挛；5级：持续站立或跌倒失平衡，四肢抽动。出现 6级以上痫性行为称充分点燃。脑电图可分为3期：1期：海马局部丛集放电；2 期：放电扩散至边缘系统的其他结构；3期：放电继续扩散至边缘系统外的其他 结构如皮层等。目前，对于难治性癫痫的研究多局限在针对手术切除的脑组织及动物模型的 癫痫脑组织上，一定程度上限制了临床实践，因此寻求客观的外

16、周指标，有利于 协助难治性癫痫在临床中的诊治15, 16。而理想的模拟人类各种类型癫痫发作 的动物模型，为今后的临床研究打下坚实的研究基础。在现有研究基础上，有望较早的发现难治性癫痫患者，应用逆转录药物，提高难治性癫痫的治疗成功率，给患 者带来福音。参考文献1王广新，杨作成.多药耐药基因-1、脑源性神经营养因子基因的两个多态性 与小儿耐药性癫痫的关联研究J.中国药理学通报，2008, 24 (7): 933-937.2 Hoie B , Sommerfelt K , Waaler PE, et al. Psychosocial problems and seizure- related fac

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