发酵工程(李艳)第十二章 微生物细胞破碎原理与技术第二次

1、第十二章 微生物细胞破碎原理与技术第一节细胞壁的组成和结构一、细胞壁组成 细胞壁的主要成分： 细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸) G+:细胞壁较厚，只有一层。G-:肽聚糖层较薄，最外面还有一较厚的外壁层，主要是脂蛋白和脂多糖。 酵母：葡聚糖：最里层，构成细胞刚性骨架。甘露聚糖：最外层。蛋白质：两者之间的一层糖蛋白。 真菌: 多糖壁（几丁质和葡聚糖）pwerpoint附表各种微生物细胞壁的结构与组成 ，图示细菌细胞壁和酵母菌细胞壁的结构二、细胞破碎的方法1.机械法：动物内脏、植物叶芽、细菌等。实验室和规模生产均可利用。2.物理法： 1）超声波破碎法：应用较多，由于空穴作用。液体形成局

2、部减压引起液体内部发生流动，产生很大压力，使细胞膜破碎。超声波的频率对细胞破碎效果无显著影响，所以也可利用声波进行细胞破碎，但细胞破碎程度与输出功率和破碎时间密切相关。同时受细胞浓度、溶液粘度、PH、温度以及离子强度的影响。在实验室应用具有简便、快捷、效果好的特点。特别适用于微生物细胞的破碎。大规模工业生产中应用困难很多。 2）渗透压突变法（渗透压差法）：溶胀，利用渗透压的变化使细胞破碎。  3）温度差破碎法（冻融法）：通过温度的突然变化使细胞破碎。如将冷冻的细胞突然放入讲稿温度的水中，将在讲稿温度中的细胞突然冷冻。应用于破碎易破的细胞，用对数生长期的细胞效果更好，难以工业

3、化大规模应用。要反复多次才能达到预期效果。对冻融敏感的酶不适用。3. 化学法：应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。又称化学诱变法。常用的化学试剂有机溶剂和表面活性剂。   1）  有机溶剂处理：常用试剂甲苯、病痛、丁醇、氯仿等。原理：破坏膜磷脂结构，改变细胞膜通透性。2）  表面活性剂处理：离子型：更有效，但会引起酶结构破坏，引起酶变性失活。非离子型：Triton X-100，Tween。处理后要用凝胶层析等方法将表面活性剂除去，以免影响下一步纯化。该方法对膜结合酶的提取特别有效，在实验室和生产中已成功使用。4. 酶解法（enzymat

4、ic lysis）：通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用使细胞破碎。  （1）外加酶法：细菌：用溶菌酶，能专一性的作用于肽多糖的-1,4糖苷键。 酵母菌：蛋白酶（作用于蛋白质-甘露聚糖），再加入葡聚糖酶，再改变渗透压使细胞膜破裂，因为酵母壁厚，难对付。霉菌：几丁质酶植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合使用。（2）自溶法（autolysis）:一种特殊的酶溶方式。细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。自溶效果的好坏取决于自溶条件，有温度、PH、离子强度等。如动物细胞00C-40C，微生物细胞室温下进行。缺点：自溶时间一般较长，易引起杂菌污染，可加入甲苯、氯仿、叠氮钠

5、等杀菌剂。有的酶不仅可以使细胞壁、细胞膜破坏，也可以分解某些有效成分，可与其他破坏法联合使用。选择破碎方法的依据：1）细胞的处理量：大规模用机械法，小规模用非机械法。2）细胞壁的强度与结构。3）.目标产物对破碎条件的影响。机械法考虑剪切力，酶法考虑对目标产物是否具有降解作用。4）.破碎程度：高压匀浆法，细胞碎片细小，固液分离困难。高的产物释放率、低的能耗便于后步提取 三、细胞破碎确认 1.直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破

6、碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。第十三章发酵产物分离原理与技术一、沉淀分离（根据溶解度的不同）使溶液中的溶质由液相转变为固相析出、古老、实用、简单的初步分离方法。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的纯化。有机溶剂沉淀：多用于蛋白质、酶、多糖、核酸及生物小分子的分离和纯化。选择性沉淀（热变性和酸碱变性）：用于除去某些不耐热或在一定PH值下易变性的杂蛋白。等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。有机聚合物沉淀：发展较快的一种方法，主要使用聚乙二烯作为沉淀剂。（一）盐析沉淀法（改变离子强

7、度）1. 基本原理在水溶液中，蛋白质分子的表面除带有电荷的基团外，还含有疏水基团形成的区域。在疏水区域周围 ，水分子也有序排列成水膜。大量中性盐的加入使水的活度降低，从自由水变为束缚水。生物组织中的水分有：自由水：物理吸附力结合。 束缚水：化学力结合。向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in） ：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out） ：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。 课件示蛋白质的盐析示意图原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面

8、电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。课件图示蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域、硫酸铵沉降理论示意图、盐析原理示意图。2. 盐析用盐1）中性盐的选择常用（NH4）2SO4，其突出优点：a. 溶解度大：尤其在低温时仍有相当高的溶解度，盐析操作一般在低温下（00C40C）进行。b. 分离效果好：有的提取液加入适当的硫酸铵盐析，一步就可以除去75%的杂蛋白，纯度提高了4倍。c. 不易引起变性：有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用23mol/l浓度的硫酸铵保存可达数年之久。d. 价格便宜：废液不污染环境，可肥田。2) 盐浓度的表示 用饱和（溶解）度表示

9、: 溶液中饱和硫酸铵的体积 饱和度- 溶液的总体积3) 调整盐浓度的方式 a. 饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。 配制饱和硫酸铵溶液所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算： S2-S1V=V0 - 1- S1式中V,V0分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积S2,S1分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度b. 添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据（课件附表） B(S2-S1)W= - 1-AS2 A,B常数，与温度有关。实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下需加

10、固体硫酸铵的量）。盐析操作低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。2）冰箱中（4）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration） 、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。3. 盐析曲线的制作 如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。实验确定步骤，分六到八次加不同量的硫酸铵。先加硫酸铵至微弱混浊、静止、离心得沉淀，上清再加入硫酸铵，将每个分级沉淀部分重新溶解于缓冲液中，根据酶活力和

11、相对应的硫酸铵浓度之间关系作图，得盐析曲线。课件图示枯草杆菌a-淀粉酶发酵液的盐析曲线 4. 盐析的影响因素1) 离子强度和种类（介绍盐析常数）I：离子强度，I = MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L）S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L）Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。 Ks代表盐析效率 ，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。 当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用表示，盐析方程式可改写为： log S = - Ks I 两种盐析法：Ks分级盐析法 ：在一定的pH和温度条件

12、下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。分级盐析法 ：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。    图示几种蛋白质在不同离子强度下的盐析效果2) 蛋白质浓度： 过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。 3) pH值：等电点处最易沉淀。4) 温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在04下操作。（二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数） 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1. 沉淀机理 主要作用

13、：降低溶液介电常数，由于分子间的静电引力与溶剂的介电常数与溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，溶解度降低。 另一作用是引起蛋白质脱水而沉淀。有机溶剂蛋白质的沉淀剂和变性剂。有机溶剂破坏蛋白质之间的化学键，导致空间结构发生某种变形，疏水基团暴露，蛋白质沉淀。变形超过一定程度，导致蛋白质变性。沉淀于变性之间既有区别又有联系。2. 常用有机溶剂 沉淀能力：丙酮乙醇甲醇，但丙酮易挥发价格高，工业上多采用乙醇。用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。 3.优缺点： 优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活2)

14、有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 4. 影响有机溶剂沉淀的因素（1）温度 ：低温（0）操作。（2）pH 值：尽可能靠近其等电点。 （3）离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度 ，目的是防止蛋白质变性 （4）蛋白质浓度：适当，一般为520mg/ml （三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation) 1.原理 a.蛋白质在等电点时溶解度最低 b.不同的蛋白质具有不同的等电点 2. 使用方法 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解

15、度。3. 优点： 1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内 2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化4. 缺点： 酸化时，容易引起蛋白质失活（四）有机聚合物沉淀法 1. 作用机理： 与有机溶剂类似 ，是发展较快的一种新方法。2. 沉淀剂：常用聚乙二醇 （Polyethyene glycol，简写 PEG ）,多用分子量为600020000的 PEG。3. 优点操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。（五）选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所

16、需蛋白质的方法。 热变性 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。 pH变性 等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。 有机溶剂变性 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。 三种方法不是独立的。热变性对PH的依赖性很强，有机溶剂变性时要注意控制温度、PH、离子强度。应用选择性变性沉淀要对欲提纯的目的酶和杂蛋白的理化性质有全面了解。二、层析法 层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。图示：用色彩

17、（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography） 。层析法的基本原理：利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。mobile phase：携带样品流过整个系统的流体stationary phase：静止不动的一相层析法的分类流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相按两相所处的状态分类： 液相层析：液-固层析、液-液层析 气相层析：气-固层析气-液

18、层析按层析过程的机理分类：  吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。  分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。  离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。  凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。按操作形式不同分类：  柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。  纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。  薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。层析柱的制备与层析操作 柱

19、层析的设备：课件附低压离子交换层所用设备示意图、层析设备、记录仪、低温层析柜。 层析柱、蠕动泵（恒流泵）、紫外检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。层析操作分离前：1）树脂预处理：凝胶溶涨。离子交换纤维素需作酸碱处理。2）装柱：重力沉降法，要求均匀，无气泡。3）平衡：层析柱使用前，须用缓冲液平衡至所需的pH值和离子强度。分离中： 上样：体积尽可能小。 平衡：用缓冲液使不被吸附的杂蛋白穿过。 洗脱：    连续梯度洗脱：连续改变缓冲液的pH或离子强度。 阶梯式梯度洗脱：分段地改变缓冲液的pH或离子强度。 等温平衡洗脱：用平衡缓冲液直接进行扩展洗脱。同时进行分步收集和检测。

20、分离后：再生，平衡，保存。蛋白质定量分光比色仪(A280)法蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基（主要是色氨酸Trp和酪氨酸Tyr 的共轭双键）对紫外光有吸收，以色氨酸吸收最强，最大吸收峰为280nm。（一）吸附层析（adsorption chromatography） 1. 原理   利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。（附示意图）吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。2.吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。1）吸

21、附剂的选择：    根据吸附能力强弱分为：  弱吸附剂：蔗糖、淀粉   中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭    吸附剂的选择根据相似相溶原则：极性强的吸附剂易吸附极性强的物质；非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。 但为了便于解吸附，对于极性强的物质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附。 2）吸附剂的性质： 活性炭：常用的吸附介质。  硅胶：常用的极性吸附介质。  羟基磷灰石 （HA） Ca10(PO4)6.(OH)2 : a.微晶型的磷酸钙制品，表面有Ca

22、2+和PO43-两种带电基团； b.酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。      c.吸附原理是HA的Ca2+与蛋白质的负电荷基团作用。3. 洗脱剂     要求： 粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分,易与目标分子分离。    选择：具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相。    生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。 4. 应用 1）纯化生命物质 如：枯草杆菌-淀粉酶在弱酸性条件下，可吸附在氧化铝上，再用PH8-9的磷酸缓

23、冲液洗脱。2）浓缩溶液     200ml稀BSA溶液上HA层析柱，收集到的洗脱液只有几ml，浓度可提高数十倍。（二）凝胶过滤层析 凝胶过滤（gel filtration）又称分子筛层析（molecular sieve chromatography）、排阻层析（exclusion chromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。1. 基本原理凝胶是具有网状结构的多孔性高分子聚合物，当待分离的物质通过时，大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝

24、胶孔，流程长而后流出层析柱，达到分离纯化的目的。Powerpoint 附凝胶过滤层析示意图、凝胶层系原理图、胶体过滤法的胶球图；Size-exclusion chromatography示意图、凝胶过滤分离蛋白质示意图。凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示： Ve-Vo Kd= ViVo外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）    图示凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰。分配系数Kd的意义：1) 可定量地衡量各组分的流出顺

25、序。2) 判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，Kd差异小，分离效果差。2. 凝胶的种类和性质1) 交联葡聚糖凝胶（dextran gel） 商品名:Sephadex型号 Sephadex G10至G-200 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。葡聚糖凝胶层析介质的有关参数见powepoint附表2） 琼脂糖凝胶（agarose gel） 商品名:Sepharose （瑞典）; Bio-Gel A (美国) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。Sepharose及Bio-gel A 型号见 powerpoint 附表3）

26、丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel） 商品名为Bio-Gel,型号从 Bio-Gel P2至P-300，P值越大，孔径也越大。 以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。3. 操作：1）凝胶的选择和处理 根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。 将干胶悬浮于510倍的蒸馏水中 ，充分溶胀，抽气，装柱。2）柱的选择 采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。3）加样    体积不能过多，不超过床体积的5，脱盐时可在10左右。4）洗脱    洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。5）胶的

27、保存洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。用0.02%NaN3防腐。图示凝胶柱的装填方法4. 应用 1）脱盐。用Sephadex G-10、15、25。 2）生物大分子物质的分离纯化。凝胶对热源有较强的吸附力，可除去无离子水中的热源物质。制备注射用水。 3）分子量的测定。 4）溶液浓缩 。将Sephadex G-25或50干胶投到稀的高分子溶液中，吸水与低分子物质，离心或过滤。除去溶胀的凝胶，得浓缩溶液。（三）离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC） P1801.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。即以离子交换剂为固定相，根据流

28、动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别尔进行分离的一种层析方法。（附图）1）离子交换剂：离子交换层析中的固定相。由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。反离子又称为平衡离子，它能与溶液中的其它离子基团发生可逆的交换反应。离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。如羧甲基纤维素离子交换剂组成纤维素OCH2COO-Na+ 载体 电荷基团 反离子离子交换剂带有电荷基团的不溶性载体l       

29、  阴离子交换剂：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基DEAE C2H4N+(C2H5)2HQAE C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3l         阳离子交换剂：常用羧甲基 CM CH2COO 磺丙基 SP C3H6SO3离子交换葡聚糖 ：以Sephadex G-25, G-50为骨架，接入离子交换基团。 DEAE（QAE） Sephadex A-25，A-50；    CM（SP） Sephadex C-25，C-50 离子交换剂的选择a. 强、弱

30、离子交换剂的选择：强型：适用的pH范围广，制备无离子水 弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质 b. 阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性若<pI稳定，蛋白质带正电荷，用阳离子交换剂若>pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂2）蛋白质的电荷性质  a.在不同PH值溶液中，蛋白质具有不同的电荷数。b.蛋白质在某PH值时，所带电荷为0，在电场中不移动，此时的PH值为等电点。实验设计原理：利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分离。pI > 6.0 蛋白质带正电；pI < 6.0 蛋白质带负电。2. 阴离子交换剂分离蛋

31、白质的过程 （附图）a.平衡阶段：离子交换剂与反离子结合。b.吸附阶段：样品与反离子进行交换、c.解附阶段：用梯度缓冲液洗脱，先洗下弱吸附物质、后洗下腔吸附物质。d.再生阶段：用原始平衡液充分洗涤，即可重复使用。3. 操作 平衡 上样 平衡 洗脱 再生1）上样：上样体积不十分严格。2）洗脱:3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理。4. 应用 制备纯化生物大分子（四）疏水层析（Hydrophobic Interaction）P1871. 原理: 大多数蛋白质都溶于水，具有较强的亲水性，但实质上分子内部存在一个疏水核心，分子构象十分复

32、杂，各种分子都不同程度地存在着一些疏水集团或疏水中心区，如蛋白质分子表面含有某些非极性氨基酸侧链，这些非极性氨基酸侧链组成了蛋白质的疏水核心的中心，决定了蛋白质具有疏水的性质， 欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（hydrophobic patch），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。在高盐浓度下，蛋白质发生局部可逆变性，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。    图1-7示疏水作用层析原理的示意图。阴影部分表示蛋白

33、质表面的疏水补丁。2. 吸附剂 3. 操作 1）加样：样品溶液中补加适量的盐。  2）洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。  3）再生：除去固定相吸附的杂质，用水或 8mol/L 脲素溶液 。4. 应用 主要用于分离纯化大分子物质（五）亲和层析(Affinity Chromatography) P194 亲和层析由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：功能层析（function chromatography）、生物专一吸附（biospecific adsorption）、选择层析（selective chromatography）1.原

34、理 利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。    将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。（附亲和层析示意图）  2. 基质的选择 P195理想的基质应满足以下要求： 高度的亲水性，便于待纯化分子与之接触。 极低的非特异性吸附性（惰性），不与杂蛋白产生专一性吸附。较好的理化稳定性：当配体固化和各种因素变化时，基质很少或不受影响。具有足够的化

35、学基团：可供活化，并与配基结合。适当的多孔性，根据分离物性质定。  可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序） 琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。最常用的是琼脂糖，Sepharose，1B到10B3. 配体的选择 一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。 优良配体须具备的条件： 1）与待纯化的物质有较强的亲和力。  2）具有与基质共价结合的基团。4. 偶联（亲和吸附剂的制备） P195 配体一定，改造载体（基质）1）基质活化： 不同的载体活化需要不同的活化剂。 常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基2）引入连接臂（space arm）又称手臂（spacer ）“接臂” 的目的：克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。 “接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：A