蛋白质的测定方法

1、蛋白质的测定方法测定食物中的蛋白质含量有二种方法，一是凯氏微量法，二是自动定氮分析法。一凯氏微量法有手工滴定定氮和自动定氮仪定氮，实验者可根据经济条件设备而定。1 .原理蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。2NH2 （ CH2） 2COOH+13H2SO4 （ NH4） 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O（ NH4） 2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO42 .方法本法参照GB 5009.5 -8

2、5适用于各类食品及饲料中蛋白质的测定3 .试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。3.1 硫酸铜3.2 硫酸钾3.3 浓硫酸3.4 2%硼酸溶液（或1%的硼酸）3.5 混合指示剂：1 份 0.1%甲基红乙醇溶液与5 份 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用 2 份 0.1%甲基红乙醇溶与 1 份 0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。3.6 饱和氢氧化钠：500g 氢氧化钠加入500ml 水中，搅拌溶解，冷却后放置数日，澄清后使用。3.7 0.01mol/L 或 0.05mol/L 盐酸标准溶液：需标定后使用（配制及标定方法见附录）4 .仪器消化炉 凯氏定氮蒸馏装置万分之一电子

3、天平凯氏定氮蒸馏装置：如图所示5 . 操作步骤5.1 样品处理：精密称取0.12.0g 固体样品或25g 半固体样品或吸取液体样品520ml ， 放入 100ml 或 500ml 凯氏烧瓶中，加入0.2g 硫酸铜，0.3g 硫酸钾及320ml 浓硫酸，放置过夜后小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，取下放冷后用约210ml蒸储水冲洗瓶壁，混匀后继续加热至液体呈蓝绿透明，取下放冷，小心加 1020ml 水混匀 ， 放冷后，移入 100ml 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸

4、铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白实验。5.2 按图装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3 处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。5.3 向接收瓶内加入10ml ,12% 硼酸溶液及混合指示液1 滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10ml 样品消化稀释液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml 水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将310ml 饱和氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯中，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻璃塞盖紧，并加水于小玻璃杯中以防漏气。加紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入

5、接收瓶内，蒸馏2min ，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，然后用少量中性水冲洗冷凝管下端外部，再蒸馏1min 取下接收瓶，以0.01 或 0.05mol/L 盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10ml 试剂空白消化液按5.3 操作。6 . 计算X = (V-V0 ) XCX 0.014 B/m 100 XF 式中：X 一 样品中蛋白质含量，g 100g；V 一 样品消耗盐酸标准液的体积，ml;V0 - 空白消化液消耗盐酸标准液体积，ml;C 一 盐酸标准液摩尔浓度,mol/L;0. 014 一 1mol/L 盐酸标准液1 ml 相当氮克数.B 一 定容体积/取液量m 一样品的质量

6、，g;F 一氮换算为蛋白质计算因子。蛋白质的氮素含量不同，故换算因子不同。详见下表。蛋白质计算因子食 物 计算因子蛋，鱼，肉及制品，禽类，玉米，高粱，豆类，水果和蔬菜类6.25乳及乳制品6.38大米 5.95小麦面 普通粉 5.70全麦，大麦，燕麦，裸麦,小米，小麦面全麦5.83小麦5.80黄豆5.71花生5.46芝麻，向日葵，核桃和榛子5.30麸皮6.317. 举例设取样品0.1000g,消化后稀释至100 ml;。取10 ml样品稀释液，标准盐酸为 0.01 mol/L ,空白滴定为0.12 ml; ，样品滴定用去的标准盐酸为3.21 ml; ，测得样品中蛋白质百分率为：(3.21-0.1

7、2 ) X0.01 X 0.014 X 10/0.01 义 100 X 6.25=(3.21-0.12 ) X 8.75 = 27.0%8. 附录：( 1)标准 HCl 溶液( 0.1 mol/L HCl )配制及标定：配制：量取9毫升HCl,加适量水稀释至1000毫升。标定：精确称取约0.15克左右在270300c干燥至恒重的基准无水碳酸钠，加50毫升水使之溶解，加 10 滴溴甲酚绿-甲基红混合指示液，(量取30ml 0.2%溴甲酚绿乙醇溶液，加入20ml 0.1%甲基红乙醇溶液，混匀)用配制的盐酸滴定至溶液由绿色变紫红色，煮沸 2min,冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。同时做试

8、剂空白实验。( 2)计算：C = m(v-v0 ) X 0.0530C - HCl 标准滴定溶液的实际浓度,mol/Lm - 基准无水碳酸钠的质量,g;v - HCl 标准滴定溶液用量,ml;vo - 试剂空白HCl 标准滴定溶液用量,ml;0.0530-1.00 ml HCl 标准滴定溶液C (HCl) =1mol/L相当基准无水碳钠 g。0. 01mol/L HCl ：精确吸取标定过的0.1mol/L HCl 10 ml ，准确稀释至100 毫升。必要时重新标定浓度。9. 注意事项:9.1 干样用称量纸称重连纸一同消化，空白管同样放称量纸消化。9.2 含糖量高和油脂高的样品消化时容易溢出，

9、加热要缓慢。9.3 稀释样品时消化液过热，加水反应猛烈使样品损失；消化液过冷，加水后盐析不溶解。二、自动定氮分析法1. 原理本方法为凯氏微量定氮法，将蛋白质的氮素转化成氨，与硫酸化合成硫酸铵，然后测定氨量。由此计算出氮素含量，再乘以相应的系数即为蛋白质含量。化学反应式如下：2NH2（CH22COOH+13 H2SO4（NH4）2 SO4+6CO2+12 SO2+16H2O（NH4）2 SO4+2NaOH2 NH3+2H2O + Na2SO42. 方法来源GB/T 6432-94 本法适用于各种食物和饲料的测定3. 仪器KJELTEC AUTO 1030 ANALYZE瑞典特卡托公司）40孔消化

10、炉4. 试剂本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水（ 1）浓硫酸98% H2SO4（ 2）凯氏片（催化剂）K2SO4 + Se（ 3） 40%氢氧化钠溶液（NaOH） W/V（ 4）无水硫酸钠Na2SO4（5） 1%月酸（H3BO4吸收液 称取100g硼酸溶于10L水中。加入100ml澳钾酚绿溶液，再加入 70ml 甲基红溶液，最后加入3ml 4%氢氧化钠溶液。（6） 0.1mol/L盐酸（HCL标准溶液，标定后使用。5. 操作步骤5.1 样品消化：称取一定量的样品于消化管中（半固体样品用称量纸称取），加一粒凯氏片于消化管中，然后加入5ml 浓硫酸，放置过夜，同时做样品空白管。在消化过程中

11、，先用低温消化（防止高温消化时样品溢出），低温消化1 小时后，将温度升到最高档，至消化液无色透明。待消化液冷却后，加入少量水冲洗消化管内壁，振摇，以免内壁粘有样品以致消化不完全。然后于消化炉上再消化，直至液体无色透明。放置室温后，加水至25ml,待测。5.2 样品定氮：开启1030自动分析仪电源，输入测定时的参数，打开STEAMK钮，产生蒸气5分钟，同时调节蒸气表，使蒸气表的指针指到 NORMAL最后将消化管装入，关闭安全门，开始自动 定氮。当CYCLE OVER亮时，记录滴定结果，打开安全门，进行下一个样品测定。6. 计算蛋白质（g/100g） = （V-V0） X 0.01401 X NX f/m X100V:样品消耗盐酸标准液的体积，ml;V0:试剂空白消耗盐酸标准液的体积，ml ;N:盐酸标准溶液的摩尔浓度，mol ;0.01401: 1mol盐酸标准溶液1ml相当于氮克数f ： 氮换算为蛋白质的系数（一般样品的系数为6.25）；m样品的质量，g;7. 注意事项7.1 对含糖高的样品或油脂样品在消化过程中必须先低温消化，防止样品溢出，消化所需时间较长。7.2 样品的称样量不宜过多