水解度指标测定

1、水解度的测定方法一：（苛三酮比色法）（1）标准曲线制定:1、20g/ml甘氨酸：2mg甘氨酸定容到100ml容量瓶中。2、苛三酮显示剂：水合苛三酮0.5g ,果糖0.3g ,磷酸氢二钠11.2g ,磷酸二氢钾6g,定容到100mL稍热溶解，避过低温保存 1周。3、 40叱醇标准曲线制作试管012345678待测样品标?m ml0.000.10.20.30.40.50.60.71.00.5蒸储水ml2.001.901.801.701.601.501.401.301.001.5前二酮显示齐ij ml111摇匀，沸水浴115min,111用冷水迅速冷却至室温11140叱酉m ml5555555555

2、甘氨酸wgOD(570nm)0246810121420?因甘氨酸的分子量为：75.07,换算成-N%的口mol数的AC关系:水解度计算公式：DH->100%水解液-凡92的含量5.95，N(mg/m£)-原料蛋白质中游离-含量（附加。 g）xJOO%所以米糠蛋白的hw=7.3477N-水解液蛋白含量（凯氏定氮）F-米糠蛋白换算系数5.95方法二：采用甲醛滴定法。水解度（。/% =（水解后生成的氨基氮的量/样品中总氮含量）x 100%（1）粗蛋白含量的测定：采用凯氏定氮法。（2）氨基氮的测定氨基酸含有氨基和竣基，具有两性，加入甲醛与氨基酸中的氨基作用， 可消除其 碱性，使竣基显示

3、出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定，即可对氨基酸进行定量。1、酚吹指示剂：0.5g酚吹溶于100ml 50%的乙醇中2、中性甲醛溶液：甲醛溶液（3637%,分析纯）50ml,加入0.5%的酚丈指示 剂约3ml,滴加0.1md/L NaOH使溶液显微粉色，储存于棕色瓶中，临用前配 制。具体方法如下：分别吸取2mL不同水解度的水解液于烧杯中加蒸储水 5mL,向烧杯中加入5滴 酚吹指示剂，混合后加中性甲醛溶液 2.0ml再混合，用0.1mol/L NaOH滴定显 微粉色。同时取同浓度但未水解的蛋白液 2mL做空白实验。百行一人a /,、V-VnxNx 14.008MAt炎（含里（ing/inL）=10式

4、中：V样品耗用氢氧化钠标准溶液毫升数；V0空白耗用氢氧化钠标准溶液毫升数；N氢氧化钠标准溶液摩尔浓度；14.008 1 mL浓度为1.000 mol/L氢氧化钠标准溶液相当于氮的质量（mg）。方法三：2.2.6水斛度的测定采用pH-Stat滴定法网,汽根据多肽在不同pH的条件下解离状态不同;当pH值恒 定时前水解蛋白后形成的自由速基、 自由氮基或氮基酸战基数目不等；当在碱性条件卜 水解时，释放的氨基陵使溶液pH值明显卜“降，用稀碱液将其滴定回起始pH值，可以 知道蛋目质的肽链断裂的情况，根据消耗的碱量计算水解度DH值。水解度=(水解的肽健数/总肽健数)对00%计算公式DH = VNiCH

5、9;NNaOH >MP*Htot)*100%2-2公式中：VNa0H ：滴定消耗的碱体积(ml)NNa0H r滴定消耗的碳当量浓度51O1/L)Mp :参加蛋白水解的蛋白总量(g)Hot：每克蛋白中肽键的充当量数(9.2mmd/g)e ：匕敏基酸的平均解离度(50七时，pK=7十0.09)CF1评回。+13隹) pK=7.842400* (298-T) /298TT=273.15+t t：反应环境的温度(七) pH:反应起pH值2. 3.3水解度(DH)的测定蛋白质的水解程度常以蛋白质中的肽键被断裂的仃分率来表示，常见的水解度测定和监 控的方法主要有pH也此法(Alder-N辰E, 19

6、86)、三硝基笨璜酸法、甲醛滴定法、三氯乙酸 沉淀法等，由于pHdtat法具有操作简单，连续测定的优点，井L当pH大于6时，水解过程 中加入碱的鼠与断裂的肽键的数设有定的美系,因此,本研究采用该法来检测大米蛋白的 水麟度X100%h - Ex N&xM ctKlt M式中：h单位质量蛋白质中被水解的肽犍的量（lllllld g1）；B消耗的碱液体积，niL：Nfi碱液的浓度，molt；1/a校正系数（碱性蛋白的lh=L01”M底物中蛋白质的含砧，加%,底物中蛋白质中的肽键总数，mmol/g t大米蛋白取&40） （Hainada. 230）。氮溶指数测定（TCA-NSI）可以通过检测其氮溶解指数来初步判定小肽或寡肽含量。NSI （ % ） = （ N1/ N0） * 100N0 =总氮N1 =可溶性氮（用三氯乙酸可溶性氮测定法）三氯乙酸（TCA）是一种蛋白质沉淀剂，它可以沉淀蛋白质和较长的肽 段。可以被三氯乙酸沉淀的肽段所含的最少氨基酸残基数与底物的种类 有关，就特定的底物而言，三氯乙酸氮溶解指数可以定性反映蛋白质的 分解情况，溶解指数越高，表明较短肽段含量越高。三氯乙酸氮溶指数（TCA NSI）测定方法：将20ml 10% 三氯乙