RT-PCR及实时定量PCR

1、RT-PCR及及实时定量实时定量PCR技术原理技术原理 定义：定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内，是通过模拟体内 DNA 复制的复制的 方式，在体外选择性地将方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩某个特殊区域扩 增出来的技术。增出来的技术。n PCR技术技术:PCR概念的提出概念的提出n1983，Kary Mullis引物引物引物引物Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。Heat-stable polymerase is vital

2、to the ease of the processthermus aquaticusTaq DNA多聚酶的发现多聚酶的发现1988年年Saiki 等从温泉等从温泉（ Hot spring）中分离）中分离的一株水生嗜热杆菌的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNA聚合酶。聚合酶。 此酶具有以下特点此酶具有以下特点： 耐高温，耐高温， 在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。新酶。 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度长度(2

3、.0Kb)。 酶命名为酶命名为Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被。此酶的发现使被PCR广泛应用。广泛应用。 在在 1989 年，年，Science 将将PCR中的中的Taq DNA多聚酶命多聚酶命 名为当年的风云分子名为当年的风云分子 (Molecule of the year) 722.PCR反应过程：反应过程： 模板：单链或双链模板：单链或双链DNA 引物：引物：16-30 bp合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐热的聚合酶：耐热的DNA聚合酶聚合酶 底物：四种脱氧三磷酸核苷底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP

4、、dCTP、dGTP) 3.PCR基本要素基本要素4.PCR反应程序反应程序9496 30-3 预变性（使模板预变性（使模板DNA充分变性）充分变性）94 30 变性变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）复性（使引物与模板充分退火）72 n(按按1扩增扩增1kb计算）延伸计算）延伸 72 3-7 总的延伸（使产物延伸完整）总的延伸（使产物延伸完整）4-10 保存保存 25-35个循环个循环1）复性和延伸复性和延伸温度温度 复性的温度是复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60 之间。具体的温度主要由引物的之间。具体的温度主要由

5、引物的 Tm 值决定值决定（低于（低于Tm 值值2-3 ）。）。 延伸温度绝大多数设定为延伸温度绝大多数设定为 72 。如果复性的温度很高，。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法法 PCR 。2）反应）反应时间时间 变性一般使用变性一般使用 30 秒钟，如果模板的秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。 复性时间有复性时间有 30 秒种一般是足够的。秒种一般是足够的。 延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用延伸时间由扩增产物的大

6、小决定，一般采用 1kb 用用 1 分分钟来保证充足的时间。钟来保证充足的时间。 3）循环）循环次数次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为 2535 次。次。 平台效应（平台效应（plateau effect）：）：PCR 扩增过程后期出现扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。 原因：底物和引物的浓度已经降低，原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和和 DNA 聚合聚合酶的稳定性或活性降低酶的稳定性或活性降低 ，产生的焦磷酸会出现末端产物，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用

7、，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。彻底。 引物设计的一般原则引物设计的一般原则 长度：至少长度：至少 16bp ，通常为，通常为 18-30bp。 更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 引物的解链温度：两个引物之间的引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在值差异最好在 2-5 。 对于小于对于小于 20 个碱基的引物其个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计

8、算，即值可用简易公式计算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。）。 对于对于 14-70 个核苷酸的引物可用个核苷酸的引物可用 以下公式计算。以下公式计算。 Tm=81.5+16.6（1gK+）+0.41（G+C）%-（675/N） N 表示引物的核苷酸数目，表示引物的核苷酸数目， K+ 表示单价离子即钾离子的浓度表示单价离子即钾离子的浓度 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的 3端）。端）。 G+C 含量：尽量控制在含量：尽量控制在 40% 至至 60% 之间，之间， 4 种碱基的分布应种碱基的分布应 尽可能均匀。尽量避免嘌呤

9、或嘧啶的连续排列，以及尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在在 3 末末 端的重复排列。端的重复排列。 引物的引物的 3 末端最好是末端最好是 G 或或 C ，但不要，但不要 GC 连排。连排。2、反转录、反转录PCR RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录又称反转录PCR, 是以反转录的是以反转录的cDNA作模板所进行的作模板所进行的PCR， 可对基因的表达和序列多态性分析。可对基因的表达和序列多态性分析。聚合酶聚合酶cDNAPCR扩增AAAnAAAAnA逆转录酶逆转录酶反转录反转录 T T TnTcDNA第一链第一链m

10、RNA3.实时定量实时定量PCR( real-time PCR)常规常规PCR技术：技术：对对PCR扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定量及定性分析进行定量及定性分析定量定量PCR技术：技术：对对PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环的产物每一个循环的产物进行定量及定性分析进行定量及定性分析（1）原理：）原理： 通过特定设计的通过特定设计的PCR仪器来仪器来实时检测实时检测PCR扩扩增过程中每一轮循环产物的累积数量增过程中每一轮循环产物的累积数量，可以很好，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量定量PCR。域值域值：将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对：将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的应的荧光强度荧光强度设定为域值。设定为域值。Ct值值：荧光信号达到域值