芳基-3,二氢异喹啉类化合物的细胞毒性、构效关系及其凋亡诱导机制的研究

1、2- 芳基-3,4- 二氢异喹啉类化合物的细胞毒性、构效关系及其凋 亡诱导机制的研究含C=N<sup>+v/sup双键的天然异喹啉类化合物是种类和含量相对较少且 结构特殊的一类生物碱。该类化合物普遍具有显著的抗癌、抗菌、杀虫、消炎或 抗氧化等重要的药理活性 , 尤其在抗癌活性方面已引起了国内外药物研发人员的 高度兴趣。但该类化合物存在着化学性质活泼 , 分离和合成困难以及分子修饰位点少等 缺点, 这在一定程度上制约了该类药物的研究与应用。新药开发的一个重要途径 是以天然活性物质为先导或模板进行结构模拟。在我们课题组的前期研究中,曾以含C=N<sup>+</sup双

2、键的两个季铵类苯 并啡啶类化合物血根碱和白屈菜红碱为模板 , 采用分子模拟原理 , 设计并合 成了一系列 2-芳基-3,4- 二氢异喹啉类化合物 , 发现后者具有和其模板化合物类 似的抗菌和杀螨活性 , 证明其可作为研发季铵类苯并啡啶类药物的理想次级先导 化合物。本研究旨在进一步考察 2-芳基-3,4- 二氢异喹啉类化合物的细胞毒活性 及其构效关系 , 同时对其诱导细胞凋亡的机制进行初步研究 , 以期证明此类化合 物是否可作为其模板化合物的次级先导用于季铵类苯并啡啶类化合物抗癌药物 的研究,同时为此类抗癌药物的研发奠定一定的理论基础。本研究取得的主要结果如下:1.采用MTT法,测定并评价了 3

3、个系列共103 个3,4-二氢异喹啉类化合物（溴化2-芳基-3,4-二氢异喹啉，1类；溴化2-芳基-8- 甲氧基-3,4-二氢异喹啉，11类;溴化2-芳基-8-羟基-3,4-二氢异喹啉,III类）、 1个系列共25个2-芳基-1氰基-1,2,3,4-四氢异喹啉（I '类）及1个II '类化 合物，即2- （2-碘苯基）-1氰基-8-甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉（II ' -15）,对两种癌细胞(NB4细胞和MKN-45细胞)的细胞毒活性。结果表明,在测定浓度< 20.0卩M时,所有化合物对两种细胞的增值都表现出一定的抑制活性,且每个化合物对NB4细胞的活性显

4、著强于 MKN-45细胞。各类化合物的活性强弱次序为：1类"I '类&gt;ll类&gt;III类。大部分I 类和I '类的活性强于白屈菜红碱，但弱于血根碱；几乎所有的II类和Ill类化 合物的活性都弱于血根碱和和白屈菜红碱。其次,进一步测定了 17个I '类和28个II类活性较强的化合物对两种细胞 的毒力。结果显示，I '类化合物对NB4细胞的IC₅₀为 0.16⁰.67 卩 g/mL (0.67²

5、.24 卩 M ,其活性均强于 6-氰 基二氢白屈菜红碱(IC₅₀0.69卩g/mL,1.85卩M)和参考药物 DDP(IC₅₀0 0.72 卩 g/mL,2.39 卩 M),但弱于 6-氰基二氢血根碱 (IC₅₀0 0.19 卩 g/mL,0.53 卩 M);l '类化合物对 MKN-45细胞的 IC₅₀为 0.90³.50 卩 g/mL(2.99<s

6、up>1</sup>3.01 卩 M , 其活性均同样强于6-氰基二氢白屈菜红碱(IC₅₀0 4.74卩 g/mL,12.72 卩 M)和 DDP(IC₅₀0 3.41 卩 g/mL,11.36 卩 M),但弱于 6-氰 基二氢血根碱(IC₅₀0 0.55卩g/mL,1.53卩M);大部分II类化合物对 NB4细胞的 IC₅₀为 0.68³.81 卩

7、 g/mL(1.54⁹.61 卩 ,其活性均弱于血根碱(IC₅₀0 0.51 卩 g/mL,0.53 卩 M)、白屈菜红碱(IC₅₀0 0.71 卩 g/mL,1.49 卩 M)或 DDP(IC₅₀0 0.72 卩 g/mL,2.39 卩 M)。但是,大部分II类化合物对KMN-4理田细胞(IC₅₀&lt;3.4卩g/mL) 的活性强于白屈菜红碱(IC<

8、sub>50</sub>0 6.04卩g/mL,12.71卩M)和DPP但低 细胞的活性(IC₅₀0 0.74卩g/mL,2.39卩M)与 6-氰基二氢白屈菜红碱 和DDP相当，但弱于6-氰基二氢血根碱；对MKN-45细胞的活性(IC₅₀0 0.77卩g/mL,2.50卩M)显著强于6-氰基二氢白屈菜红碱和 DDP但弱于6-氰基二氢血根碱。最后,测定了化合物I ' ₂和I ' ₁₇

9、;对两株正常细胞 原代的羊胎儿成纤维细胞和原代的猪胎儿肾细胞的毒性。结果显示，除了 I '₂对原代的猪胎儿肾细胞的毒性稍高其对MKN-45细胞外,1 '₂和I ' ₁₇对两种正常细胞的毒性低于 DDP也低于其对 癌细胞的毒性 , 表明两种化合物对癌细胞具有较高抑制选择性。2. 对供试化合物的结构与其细胞毒活性之间的构效关系进行了研究。 结果表 明：(1) I类和相应的I '类化合物对两种癌细胞具有近似相同的毒性，表明后者 可能

10、是前者的前药物。类似的情况也存在于血根碱和 6-氰基二氢血根碱或白屈菜红碱和 6-氰基二 氢白屈菜红碱上。(2)对于I类、I '类、II类和III类化合物来说，对N-苯上 取代基的种类、数目和位置均可显著影响化合物对两种癌细胞的活性。(3) I类和I '类化合物具有完全相同的构效关系：向N-苯环上引入吸电子 基, 如卤素 , 三氟甲基和硝基等 , 可显著增强其活性。 相反, 供电子基团如甲基和甲 氧基等的引入则导致活性降低；对于弱吸电子的卤素原子取代形成的I类或I ' 类异构体而言,2 '-卤代物的活性最高。类似的情况也存在于供电子取代基所形成的I类或I 

11、9;类异构体上。此外， 二卤代物较相应的单卤代物活性高 , 表明增加卤原子取代数目可增强活性。对强吸电子的三氟甲基或硝基来说,3 '-取代物的活性最高，而2'-取代异 构体的活性最小。(4)对 II 类化合物来说 , 取代基种类对活性的影响与 I 类化合 物的情况相似但不完全相同 , 总的趋势仍然是吸电子基增强活性 , 供电子基降低 活性。对NB4细胞而言，当取代基为卤素时,4 '-卤代的异构体均给出最小的活性。 对于氟或氯而言,2 '-卤代异构体活性最高，而对于溴或碘时,3 '-卤代异构体活 性最高；就KMN-45细胞而言,所有II类2'-卤代

12、异构体均显示出最高的活性,但 3'-卤代异构体和4'-卤代异构体的活性则依取代基种类的不同而不同。对 II 类化合物来说 , 氰基或三氟甲基的位置异构对细胞的活性影响依细胞 种类的不同而具有不同的规律 , 表明强吸电子基的类型和位置均显著影响 II 类 化合物对不同细胞的敏感性。与 I 类化合物的情况类似 , 二卤代物的活性一般稍 高于其相应的单卤代物 , 表明增加卤原子取代数目可增强活性。(5) 8-0H的引入可显著降低所有I类化合物对两种癌细胞的活性；8-OCH3 引入可增强部分化合物活性,尤其是对KMN-45细胞的活性。3.以l<sub>2</sub&g

13、t; 和 I₁₇ 为代表性化合物 , 研究了它们及其模板化合物血根碱和 白屈菜红碱的抗氧活性。结果表明,四个化合物在较高浓度时均有一定的清除DPPHI由基和ABTS自由基的能力，同时也具有抗 Cu<sup>2+v/sup>/Hvsub>2v/sub>O<sub>2v/sub：体 系诱导BSA蛋白氧化损伤的活性。四种物质的抗氧化活性的强弱次序为：血根碱 &gt； 白屈菜红碱 &gt；I₂&gt；I<sub>17</sub&

14、gt; 。但是, 四种物质的抗氧化能力均远远低于参考物质 Trolox, 其抗氧化的IC₅₀值也远高于其对癌细胞的IC₅₀值，表明其对癌细 胞的增殖抑制可能与其抗氧化活性无关。4.通过细胞的DAPI染色、AO/EB染色、 超微结构分析和蛋白酶活测定,研究表明，1 '类样品对NB4细胞和MKN-45细胞具 有较为显著的凋亡诱导作用 , 且具有浓度依赖性。其机制可能是通过引起ROS勺过量形成而到导致细胞凋亡。流式细胞分析表 明，供试化合物引起的凋亡细胞的多为早期凋亡细胞 ，且对细胞周期的阻滞无显 著

15、影响。5.通过QRT-PC法测定12个凋亡相关的基因表达发现,代表样品I '₂可以引起CFLAR,THBS1,CCN的mRN表达水平的上调,且具有极显 著性差异(p&lt;0.01 ) ;TNF,CYCS,CASPASECCNE2,GTSE的 mRN表达水平均 上调，且具有显著性差异(p&lt;0.05 ) ;FAS,BAX和HDAC的 mRN表达水平的升 高，但无显著性差异;BCL2的mRN表达水平下调，但无显著性差异。通过Western blot实验研究发现，样品I ' ₂可通过线粒体介导的内源途径，如下 调Bcl-2/Bax 的蛋白表达，上调cyto-c 和上调cleaved