口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

1、口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定田美娜，李永亮 卢曾军，付元芳，袁明，刘湘涛，刘在新【摘要】目的：制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb)。方式：以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c 小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，杂交瘤细胞经间接 ELISA 法挑选，有限稀释法克隆，直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体， 用Western blot和间接免疫荧光法对mAbsW特异性等进行鉴定。结 果：免疫的BALB/c小鼠通过量次融合挑选，共取得5株抗pET28a 3D的mAb,其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b,初步判定所得5 株mAb识别2

2、个不同表位。Western blot显示这些mAbsW重组3D蛋 白和FMDO/China99感染的BHK 21细胞中的3D抗原均特异性结合， 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMD避染细胞中的3D蛋 白。结论：成功取得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb ,为进一步 研究3D蛋白的结构和功能和诊断方式奠定基础。【关键词】口蹄疫病毒；非结构蛋白3D;单克隆抗体；原核表 达口蹄疫(foot and mouth disease, FMD) 是由口蹄疫病毒 (foot and mouth disease virus, FMDV)I发的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病，世界动物卫生组织将其

3、列为A类传染病之 首，该病一经暴发就会给畜牧业生产造成庞大的经济损失 ，严峻阻碍 了政治、经济的稳固进展，世界各国都高度重视对该病的防控，完善 的诊断和检测技术体系是操纵和消灭该病的关键。检测非结构蛋白抗 体的ELISA方式不受血清型限制，因此在疫情普查、筛查感染动物、 防制成效评判和恢复无FMD犬态等方面具有重要的应用。FMDV勺3D蛋白是具有469个氨基酸的病毒RNA&托的RNA!合 酶，又称病毒感染相关性抗原，没有型特异性，在FMD所有非结构 蛋白中，3D抗原性最好，检测3D的ELISA方式具有与检测结构蛋白 的ELISA方式相当的特异性、准确性和灵敏性，是评判动物是不是接 触过

4、抗原的重要指标，在检测中具有重要的应用前景1-4。本实验利用原核表达的3D蛋白制备单克隆抗体（mA。,为成立 更为完善的ELISA诊断方式和检测技术和进一步研究3D蛋白的结构和 功能提供基础资料。1材料和方式材料O/China99 口蹄疫病毒、BHK 21细胞株、 牛抗FMDV 高免血清均为本实验室保留，Sp2/0骨髓瘤细胞为兰州市市肿瘤医院 惠赠，3D蛋白原核表达重组菌由刘湘涛研究员惠赠，SPF级雌性34周龄BALB/c小鼠购自兰州生物所，福氏佐剂、聚乙二醇（PEG）1450溶液、HAT、HT和四甲基联苯胺（TMB）、HRP标记羊抗小鼠总IgG、 mAb®型鉴定试剂盒均为 Sigm

5、a产品；RPMI1640培育基、新生牛血为Hyclone公司产品，FITC标记羊抗小鼠IgG购于KPL公司，HI Trap rProtein G FF, 1 m蛋白纯化柱为 Amersham公司产品，NiNTAPurification System购于Invitrogen 公司，其他试剂均为入口分装 或国产分析纯。方式重组pET28a 3D蛋白的表达、纯化及活性鉴定 按文献5所述方式表达 3D蛋白，将可溶性表达的3D蛋白按 Ni NTAPurificationSystem操作说明书进行纯化，用SDS PAG曲泳鉴定纯化产物的纯度，用Western blot 鉴定其特异性。Western blo

6、t 方 式参照文献6进行：以牛抗FMD涓免血清为一抗，Sigma公司辣 根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG为二抗，DAB染色。3D mAb勺制备（1）小鼠免疫：取纯化的抗原按100 wg/只加 等体积弗氏完全佐剂背部皮下注射，2周后用弗氏不完全佐剂第2次 免疫，剂量、注射部位同前，2周后以不加佐剂的等量抗原于后肢内 侧皮下注射,1周后采尾静脉血测抗体效价，取抗体水平较高的小鼠 于1周后尾静脉增强免疫1次，在此以后第3天融合。（2）阳性杂交瘤细胞株的成立：采纳常规的PEG立合的方式取其脾细胞与小鼠骨髓 瘤细胞Sp2/0融合。用纯化的重组pET28a 3D蛋白包被聚苯乙烯板， 取融合后第1015天的细

7、胞培育上清进行间接ELISA检测，选择检测 结果为强阳性的克隆扩大培育，同时用有限稀释法至少持续克隆35次，直至所克隆的细胞能够100粉泌抗体。将能稳固分泌抗体的杂 交瘤细胞扩增培育后，冻存于液氮中。腹水的制备 将mL降植烷注射到10周龄左右的健康雌性BALB/c小鼠的腹腔，1周后注入106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔，710 d后，当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，4 C, 12 000 g 离心10 min 后，wm滤器过滤后用G蛋白柱纯化，加500 mL/L甘油分装备用。mAb效价滴定间接ELISA方式鉴定，用纯化的pET28a 3D抗 原包被ELISA板，腹水从100倍开始做梯度稀释，同时以Sp

8、2/0腹水 做一样稀释度对照。mAb的生物学特性鉴定（1）亚型鉴定：用IgG亚类鉴定试剂盒 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit（Sigma 公司）鉴定,按说明书中的捕捉ELISA方式操作。（2）稳固性测定：将阳性杂交瘤细胞 体外持续传代培育3个月，每隔10 d检测1次细胞上清液的ELISA 抗体效价。同时别离苏醒冻存1个月，2个月，3个月的阳性杂交瘤细 胞，用间接ELISA法测定细胞培育上清的抗体效价。（3）mAb的位点分 析：用ELISA叠加实验进行位点分析。用纯化的重组 pET28a 3D蛋 白包被聚苯乙烯板，加入100 L mAbl, 37 C

9、 , 1 h, 洗涤3次，力口 入 100 wL mAb2, 37 C , 1 h,洗涤 3 次，加入羊抗鼠 IgG HRP,37C, 1 h,洗涤5次，加入底物显色，终止反映后测定A值。依照如下公式 计算叠加率 AI: AI= A(1+2)-A1 /A2X100% 式中 A1 为 mAb1 的 A 值，A2 为 mAb2的A值,A(1+2)为 mAb1叠加 mAb2的A值。假设 AI>10 %,说明被测的2株mAb的抗原结合位点不同，AI W10%那 么结合位点相同或相近。(4)特异性鉴定：Western blot:将原核表 达的pET28a 3D蛋白和灭活的O/China99

10、株感染的BHK 21细胞裂 解液别离进行SDS PAGE!泳，然后按常规方式转印到硝酸纤维素膜 滑腻面上，将膜置于封锁液中,4 C,留宿，PBST洗涤5次后别离置 于5株杂交瘤细胞上清中，设置阳性对照(免疫鼠血清)、阴性对照 (正常鼠血清),37 C作用1 h, PBST洗涤5次，置于工作浓度的HRP 标记羊抗鼠IgG溶液，37 C作用1 h, PBST洗涤5次，最后用TMBt 光显色，水洗终止反映。间接免疫荧光：接种FMDVO/China99于长 满单层的BHK 21细胞，50 mL/L CU、37 c培育10 h,弃去上清， 用洗涤液(PBS 10 g/L BSA )洗涤1次,37 g/L

11、多聚甲醛室温固定 10 min,洗涤3次；加入50 mmol/L NH4Cl,室温作用10 min,充分 洗涤，吸干残液；加入杂交瘤细胞培育上清，37 C作用1 h,洗涤3 次，吸干残液；加入工作浓度的羊抗鼠IgG FITC, 37c作用1 h,洗 涤3次，加200300区L 20 mL/L甘油PBS,荧光显微镜下观看，同 时设立BHK 21细胞作为阴性对照。2结果重组pET28a3D蛋白的纯化及活性鉴定 纯化蛋白经SDSPAG分析，在相对分子质量（Mr）约44 000处有一条明显的蛋白带（图 1A）,与预期相符，而且无明显的杂带，这说明提纯的抗原较纯。Western blot结果显示，纯化的

12、原核表达抗原能够专门好的识别 FMDV 感染的动物血清，具有良好的反映性（图1B）。图1 3D蛋白的纯化及 活性鉴定A: 3D融合蛋白的SDS PAGES度鉴定；B: 3D蛋白的活性鉴定. M:蛋白 markers; 1: 纯化的 pET28a 3D蛋白；2: pET28a 3D蛋 白的 Western blot 分析.pET28a 3D蛋白mAbfe交瘤细胞株的成立 以表达的重组蛋白 免疫小鼠，经细胞融合及5次克隆化，阳性率达到了 100%,共取得5 株稳固分泌抗3D蛋白的杂交瘤细胞株，别离命名为：1A六、1B二、 1E五、7H4 和 7CZ抗体效价滴定结果和亚类鉴定 结果如表1所示，5株m

13、AbW腹水抗体效价均高于105,达到mAb腹水制备的要求。表1 mAb效价测定及亚类鉴定结果mAb的生物学特性鉴定稳固性鉴定持续传代培育和按期苏醒的杂交瘤细胞，其上清的抗体效价一直稳固，说明杂交瘤细胞能稳固分泌mAb位点叠加分析 表2结果显示，其中1B二、1E五、7c2之间 的叠加值均小于10%,为识别同一个表位的抗体，1A6和7H4与以上 3株抗体的叠加值均大于或接近于 10%,识别不同或相近的表位，且 mAb1叠加mAb2W mAb2ft加mAb1AI值相差较大，但表位判定结果 一致。表2 5株mAbfi点叠加分析结果特异性鉴定 （1）Western blot: 图2所示，在Mr约44 0

14、00 处有一条明显的蛋白带，这说明所挑选出的5株mAbfg与原核表达的 3D蛋白发生特异性反映；图3中在Mr约52 000和72 000处各存在 明显的蛋白带，别离与自然的FMDWD和3CD蛋白大小相符（2）间接 免疫荧光：在FMD避染的BHK 21细胞细胞质中均检测到很强的荧 光（图4）,而未感染FMDV勺细胞检测2果为阴性，这与Garc a Briones等7所得结论一致。3讨论高度纯的抗原是取得特异性mA矫口提高挑选阳性率的关键。 原核表达系统尽管没有蛋白翻译后的糖基化、磷酸化等加工修饰进程不能完全反映蛋白的天然构象，可是由于原核表达系统操作简便、重组蛋白产量高、能够利用配套纯化方式对重

15、组蛋白进行高度纯化等诸 多优势，而且目前许多实验室已经利用原核表达的抗原成功的制备了 能够识别自然蛋白的 mAb8, 9,因此，本实验采纳原核表达的重 组3D蛋白免疫小鼠。本实验在制备mAbW基础上利用叠加ELISA进 行了抗原表位的初步研究，假设两种mAbW结合位点较远，那么将无 干扰现象，假设结合位点较近或存在部份重叠，那么有干扰现象。运 用叠加ELISA分析，初步判定这5株mAb中有2株为同一表位，其他 为不同表位，且mAbtt加mAb2j mAb2ft加mAblA值大体相近，尽 管所测AI值不同比较大，但表位判定结果大体一致。本实验的目的是制备能识别自然 3D蛋白的mAb, Weste

16、rn blot 和间接免疫荧光结果显示所制备的5株mAb不但能与原核表达的3D蛋白特异性的结合，而且能与自然3D蛋白发生特异性的结合，这为 咱们成立基于mAb勺间接捕捉ELISA或竞争ELISA诊断方式、研发新 型的多重NS流体荧光检测技术和进一步研究 FMDVJD的功能、揭露 FMDV勺致病机制提供重要工具。【参考文献】1谢庆阁.口蹄疫 M .北京：中国农业出版社，2004:30-115.2 Clavijo A, Hole K, Li M, et al. Simultaneous detection of antibodies to foot and mouth disease non st

17、ructural proteins 3ABC, 3D, 3A and 3B by a multiplexed Luminex assay to differentiate infected from vaccinated cattle J. Vaccine, 2006, 24(10): 1693-1704.3 Clavijo A, Wright P, Kitching P. Developments in diagnostic techniques for differentiating infection from vaccination in foot and mouth disease

18、J . Veteri J, 2004, 167: 9-22.4 Yang M, Clavijo A, Li M, et al. Identification of a major antibody binding epitope in the non structural protein 3D of foot and mouth disease virus in cattle and the development of a monoclonal antibody with diagnostic applications J . J Immunol Methods, 2007, 321(1-2): 174-181.5 韩雪清，刘湘涛，林祥梅，等.口蹄疫病毒3D蛋白在体外 的表达纯化及二级结构分析J.微生物学杂志，2005, 25(5): 6-11.6 郭尧军.蛋白质电泳实验技术M . 2版.北京：科学出版社，2005: 257-265.7 Garc a Briones M, Rosas Mar ia F, Gonzdez Magaldi M, et