病毒的分离鉴定学习教案

1、会计学1病毒的分离鉴定病毒的分离鉴定第一页，编辑于星期日：十八点 二十二分。“全程冷链全程冷链”第1页/共21页第二页，编辑于星期日：十八点 二十二分。1 1动物接种动物接种动物分离病毒法：乳小白鼠（动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄）日龄）优点：优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离；缺点：缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差异；接种途径：接种途径：脑内接种脑内接种皮下接种皮内接种腹腔接种肌肉接种静脉接种实验动物的观察：实验动物的观察：动物的发育、活动力、食欲和粪便特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、瘫痪、抽搐等直至死亡有些实验还需

2、测量动物的体温和体重第2页/共21页第三页，编辑于星期日：十八点 二十二分。（1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变 组织培养分离法：组织培养分离法：没有隐性感染没有隐性感染没有免疫能力的抵抗力没有免疫能力的抵抗力接种量大接种量大培养条件易于控制培养条件易于控制加速病毒的分离过程加速病毒的分离过程汉坦病毒敏感的培养细胞汉坦病毒敏感的培养细胞l首先发现人肺癌细胞（A549）l其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等2 2组织培养组织培养第3页/共2

3、1页第四页，编辑于星期日：十八点 二十二分。细胞病变（细胞病变（CPE ）：）：1、分布均匀的小颗粒状破坏病变；2、局灶状小颗粒状破坏；3、细胞圆化，呈局灶性葡萄状的堆积；4、细胞融合。圆缩；脱落；聚集；破碎；第4页/共21页第五页，编辑于星期日：十八点 二十二分。3鸡胚培养鸡胚培养优点：优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便；缺点：缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡；4蚊虫分离病毒法蚊虫分离病毒法经口感染经口感染胸腔接种胸腔接种优点：优点：病毒可长时间保存在蚊体内； 蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大；缺点：缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒；第5页/共

4、21页第六页，编辑于星期日：十八点 二十二分。第6页/共21页第七页，编辑于星期日：十八点 二十二分。1）蚀斑（蚀斑（plaque）测定）测定 可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU） 2）50%感染量或感染量或50%组织感染量（组织感染量（ID50或或TCID50）测定）测定（一）（一）病毒的数量与感染性测定病毒的数量与感染性测定 二、病毒的鉴定结晶紫染色中性红染色第7页/共21页第八页，编辑于星期日：十八点 二十二分。 1）病毒核酸类型的测定）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等）理化性状的检测：大小及

5、结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3）血清学鉴定）血清学鉴定 ELISA；IFA；（二）（二）病毒理化性质及血清学鉴定病毒理化性质及血清学鉴定第8页/共21页第九页，编辑于星期日：十八点 二十二分。阳性分离物上清阳性分离物上清提取总提取总RNA反转录合成反转录合成cDNA直接测序或克隆测序直接测序或克隆测序PCR扩增扩增（三）（三）病毒分子生物学鉴定病毒分子生物学鉴定第9页/共21页第十页，编辑于星期日：十八点 二十二分。什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应n聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是

6、一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由由K. Mullis于于1983年建立年建立；可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析；可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列的序列的相互作用。相互作用。 第10页/共21页第十一页，编辑于星期日：十八点 二十二分。PCR技术的工作原理技术的工作原理PCR操作过程操作过程1、预变性（预变性（Initial denaturation）：）： 模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95加热3-5分钟；2、引物退火（引物退火（Primer annea

7、ling）：）：退火温度一般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有较大影响；3、引物延伸（引物延伸（Primer elongation）：）：引物延伸一般在72 进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩增片段长短而定；4、循环中的变性步骤：循环中的变性步骤：循环中一般95，30秒足已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败；5、循环数：循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产生非特异条带；6、最后延伸：最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 维持5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。第11页/共21页第十二页，编辑于

8、星期日：十八点 二十二分。PCR的各种变体的各种变体反向PCR（Inverse PCR，IPCR）不对称PCR（Asymmetric PCR）多重PCR荧光定量PCR（Q-PCR）反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）巢式PCR（NEST PCR）递减PCR（Touchdown PCR）第12页/共21页第十三页，编辑于星期日：十八点 二十二分。可用于可用于mRNA的半定量分析的半定量分析 反 转 录反 转 录P C R ( r e v e r s e transcription-PCR，RT-PCR) 是是一种简单、快捷地对一种简单、快捷地对RNA进

9、行定性、进行定性、定量分析的方法。它是以定量分析的方法。它是以mRNA为为模板，体外扩增模板，体外扩增cDNA，再以，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物为模板进行特定基因转录产物的的PCR扩增。扩增。RT-PCR技术一般用于技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测，则可对待测RNA样品进行半定量分样品进行半定量分析。析。该方法适合对待测样品进行初步该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被实时定量筛选，目前已广泛被实时定量PCR替代。替代。1反转录反转录PCRTrans反转录酶系列 第13页/共21页第十四页，编辑于星期日：十八点 二十二分

10、。 常用于常用于mRNA的定量分析的定量分析 实时定量实时定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR) 是定量分是定量分析析mRNA的最通用、最快速、的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。有很高的灵敏度和特异性。2实时定量实时定量PCRSYBR Green实时定量实时定量PCR分析原理示意图分析原理示意图 第14页/共21页第十五页，编辑于星期日：十八点 二十二分。*目前有目前有5种技术用于实时定量种技术用于实时定量

11、PCR 其中最经济、简便的技术是利用其中最经济、简便的技术是利用荧光染料荧光染料（如（如SYBR Green ）与双链）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产物的增加；分子结合发光的特性，指示扩增产物的增加； 其他其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针与正种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针与正确的扩增子杂交，包括确的扩增子杂交，包括5核酸酶法核酸酶法（即人们熟知的（即人们熟知的TaqManTM）、）、分子信标分子信标、ScropionsTM和和探针杂交法探针杂交法，它们拥有更强，它们拥有更强的特异性，可以避免对的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的需求，以及后后溶解曲线的需求

12、，以及后续的续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定，但是杂交或对扩增子的测序鉴定，但是成本较高成本较高。第15页/共21页第十六页，编辑于星期日：十八点 二十二分。芯片技术芯片技术nDNA芯片（芯片（DNA chip）在固相支持物上有序固化寡在固相支持物上有序固化寡核苷酸或核苷酸或DNA探针，与待探针，与待测荧光标记样品进行杂交；测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达基因序列及表达)； 亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。基因芯片工作流程基因芯片工作流

13、程第16页/共21页第十七页，编辑于星期日：十八点 二十二分。三、生物信息学是预测基因组结构和功三、生物信息学是预测基因组结构和功能的重要手段能的重要手段n数据库的建设：数据库的建设：汇集汇集了大量了大量DNA序列、蛋白质序列、蛋白质信息信息预测基因、基因产物的结预测基因、基因产物的结构、功能；分析基因构、功能；分析基因-基基因、基因因、基因-产物、产物产物、产物-产物之间的相互作用或联产物之间的相互作用或联系；描述细胞或整体水平系；描述细胞或整体水平的基因表达谱；推测系统的基因表达谱；推测系统发生关系。发生关系。人类X染色体图谱第17页/共21页第十八页，编辑于星期日：十八点 二十二分。NC

14、BI数据库数据库NCBI首先创建首先创建GenBank数据库数据库 于于19911991年开发了年开发了Entrez数据库检索系统，该系统整合了数据库检索系统，该系统整合了GenBank、EMBL、PIR和和SWISS-PROT等数据库的序列信息以及等数据库的序列信息以及MEDLINEMEDLINE有关序列的文献信息，并通过相关链接，将他们有机地有关序列的文献信息，并通过相关链接，将他们有机地结合在一起结合在一起NCBI还提供了其他数据库，包括在线人类孟德尔遗传还提供了其他数据库，包括在线人类孟德尔遗传( (OMIM）、三维蛋白结构的分子模型数据库（、三维蛋白结构的分子模型数据库（MMDB）、人类基因序列集）、人类基因序列集成（成（UniGene）、人类基因组基因图谱（）、人类基因组基因图谱（GMHG）、生物门类）、生物门类（Toxonomy） 等数据库等数据库第18页/共21页第十九页，编辑于星期日：十八点 二十