浅谈色谱方法验证原则

1、浅谈“色谱方法验证原则”张哲峰史继峰（国家食品药品监督管理局药品审评中心审评三部）摘 要“色谱方法验证”是为保证色谱方法的可靠性和准确性进行的方法学验证，是建立和使用色谱方法所必需进行的实验步骤。本文系参照美国药品审评和研究 中心（）“色谱方法验证审评指南”的思路及其要点，在参考美、英、欧药典中有关色谱方法的要求以及国内专家有关论述的基础上，结合我国新药研发中 色谱法应用现状编辑整理而成。文章以为主，阐述了色谱法在新药的制备工艺研究、中间体控制、质控检验、稳定性考察及药物动力学研究等方面应 用的注意要点，尝试提出“色谱方法验证原则”，以期对新药研发及技术审评有所参考。色谱方法因具有分离分析的特

2、殊优势而在新药研发中广为应用，包括原料药、中问体、制剂和生物体液中化合物的定性和定量，涉及的成分包括手性或非手性药物、过程杂质、残留溶媒、附加剂（如防腐剂）、分解产物、从容器和密闭包装或制造过程中带入的杂质、植物药中的农药和代谢物等。可见，色谱方法的可行性是至关重要的，色谱方法的验证在新药研发中占有举足轻重的地位。色 谱方法运用的目的是得到准确、可靠的数据，包括制备工艺研究、中间体控制、质控检验、稳定性及药物动力学研究等过程。得到的数据用于药品研发或批准后的定 性和定量，试验包括原料的验收、产品出厂检验、过程检验（）的质量保证。色谱方法的验证是由药品的研发者或生产者来检 验其方法是否达到预期的

3、可靠性、准确度和精密度的过程。色谱类型色谱是一种分离分析技术，通过该技术，先将样品中的组分分离，再逐个进行分析，因此是分析混合物、检测化合物纯度的最有力手段。高效液相色谱法（）法通常分为以下类型：手性液相色谱分离光学异构体可用手性固定相、衍生化后在非手性固定相上或在非手性固定相上用流动相手性添加剂形成非对映体来实现。离子交换色谱使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离；带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。可用口程序洗脱。离子对亲和色谱常

4、用反相离子对色谱，用缓冲液和加入的对离子（与被分离的样品荷相反电荷）分离。分离受、离子强度、温度、浓度和共存的有机溶剂类型的影响，亲和色谱， 一般用于大分子，使用配合体（共价结合在固体基质上的生物活性分子），与其同类的抗原（分析介质）反应，生成可逆转的复合物，通过改变缓冲条件洗脱。正相色谱将各种不同的有机官能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上，固定相极性流动相极性。常用固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。适于分离水溶性的极性、强极性化合物，此时较小极性的组分比较大极性组分更快地洗脱。反相色谱将 各种不同的有机官能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上，固定相极性流动相

5、极性。常用固定相：烷基、苯基等非极性有机分子，最常用柱或 柱，其极性很小，适于分离非机性、弱极性离子型样品。是当今液相色谱的主要分离模式，通常用紫外检测器，用水作基本溶剂，选择性受溶剂强度、柱温和 的影响，一般来说较大极性比较小极性组分洗脱更快。紫外检测器可以用于所有液相色谱，这类检测器要注意的是氘灯老化后的灵敏度降低，其灵敏度因仪器的设计和或者制造厂家的不同而异。用紫外检测器和反相组合得到的色谱图不一定能真实的反映实际情况，原因是：极性比目标化合物大得多的化合物可能被掩盖（在溶剂前沿或死体积时同时洗脱）；极性比目标化合物小得多的化合物洗脱出来晚，甚至保留在柱上。如有此情况，最好使用梯度洗脱法

6、。无紫外吸收或在检测波长处吸收相差较大的多种化合物，有时在某一检测波长处不能被检出，因为通常只用一个检测波长。如有此情况，可改用其它类型检测器。如示差折光检测器，流动相许可时，最好使用蒸发光散射检测器。分子排阻色谱以多孔凝胶（如葡萄糖，琼脂糖，硅胶，聚丙烯酰胺等）作固定相，依据样品分子量大小达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被滞留，后被洗脱。根据样品性质可分为两类：凝胶过滤（）一用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖；凝胶渗透（）一用于分析脂溶性榉品，如测定高聚物的分子量。主要依据分子量蚰大小进

7、行分离，因此与样品、流动相间的相互作用无关。因此不采用改变流动相的组成来改善分离度。气相色谱（）气相色谱基于挥发性样品由作为流动相的载气运载，通过色谱柱内的固定相时发生吸附和解吸附过程进行分离。通 常分析的样品是低分子量、易挥发、高温稳定的化合物。药物和药物制剂中的残留溶剂适于分析。常用的检测器有用于含碳化合物的火焰离子化检测器 （），用于卤化物的电子捕获检测器（），用于含硫或磷化合物的火焰光度检测器（），以及用于含氮或磷化合物的氮磷检测器（）。填 充柱已多被毛细管取代来改进分离度和分析时间，分析物位置与一样，用保留时间（）表示。、薄层色谱（）薄 层色谱是一种最简便普通的色谱技术，系将适宜的固

8、定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层，待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作 对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定（已少用）的方法。对于本身没有颜色的化合物，检出技术包括荧光、紫外和喷雾显色剂。分析物在薄层板上的位 置用值（化合物的展开距离与溶剂前沿的比值）来表示。一三种方法中，薄层色谱最普通，因为薄层板上所有的组分都可用适宜的检测技术检出，但通常不如准确和灵敏。虽然选用适宜的检测技术，法能见到分析的“全图”（），但分析变异比大。定性与定量 法的主要职能是用于药物的定性鉴别，可从斑点的位置（值）与颜色两方面对药物进行定性，优于和法（只能从色谱峰保留时间把握药物的定

9、性性 质），定量时仅用于有关物质的限度检测（半定量），结合不同原理的检视技术，法能见到分析的“全图”（），使各有关物质斑 点均可显示，但变异比法大；和法的主要优势为定量，但如果运用得当，尤其在含量测定或有关物质项下已采用本法的情况下，利用对照品与 供试品保留时间相同的特性作为鉴别依据，既不必专门实验又增加了鉴别的专属性，是非常可取的。由于分离分析的定量优势，或法成为新药研发不可 缺少的手段。尤其生物样品中药物的定量，或法几乎是唯一的分析手段。定性鉴别色谱法对同系物或具有相同母核药物（尤其制剂）的鉴另具有光谱法和化学法无可比拟的优势。但方法专属性须经充分验证，确保结构相近化合物或最难分离物质对在

10、拟定色谱条件下能良好分离。问题：在实际操作中有时遇到同一物质在完全相同的色谱系统中保留时间不一致的情况，药典中对保留时间（斑点位置）的一致性未予具体规定。建议：注意色谱系统的稳定性，流动相（展开剂）与固定相相匹配，在柱的反相色谱系统中，流动相有机溶剂比例不低于，避免链的随机卷曲将造成色谱系统不稳定导致组份保留值波动的现象；的色谱展开要适中，使主斑点的值在问。操作中另配制一供试品与对照品等量混合的溶液，进样（点样）后出现单一色谱峰（斑点）作为鉴别依据。以弥补该法之不足。（有关物质的）限度检查 法因设备和操作简便、检视（显斑）方法多而较常用，但由于其变异性大，应充分验证系统的适用性，使各斑点值在之

11、间，并应分离清晰。新版 欧洲药典提出了斑点分离度计算公式：（）（：分离度，：溶剂前沿，：比移值，魄、“：斑 点宽），可积累经验予以采纳。杂质检测可用对照品比较法或自身对照法，前者用于已知杂质控制并需杂质对照品，也可两种方法结合应用，自身对照法应注意杂质 斑点与主成分斑点色调应一致，具有可比性，必要时可选用荧光薄层板，利用荧光熄灭法检视，或两种检视方法结合应用。结果的判断，除控制杂质的斑点数与限度 外，也可采用两种以上不同浓度的对照溶液分别比较。如某药品，用自身稀释成和两种浓度的对照液，供试液如显杂质斑点，不得多于个，允许 个超过，但不得过，其余杂质斑点均不得过作限量要求。建议：配制多个展开剂系

12、统及不同的吸附剂，进行几种组合的试验，将主成分与已知的中间体、副产物、降解物或异构体斑点的颜色及分离情况进行对比，确定最佳色谱系统。采用适宜的稀溶液验证其灵敏度，确定合适的检视方法。处理好灵敏度与杂质限度的关系。适当改变展开剂比例及值，考察检测方法的耐用性。根 据药物的理化性质，法首选柱；流动相首选甲醇一水系统，必要时加入某种溶剂如乙腈或少量酸碱溶液、缓冲液等，以硅胶为载体的键合固定相填充 剂适用的流动相，大于时，可使载体硅胶溶解，此时应选用包覆聚合物填充剂、高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、非硅胶填充剂或 有机一无机杂化填充剂等耐碱填充剂；小于时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落，

13、此时应选用有机一无机杂化填充剂、具有大体积侧链能产生空问位阻保 护作用的二异丙基或而异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶等耐酸填充剂；如分离不好可选用其它类型柱和流动相，对某些品种需用特定牌号的填充剂方能满足分离要 求时，可注明适用的牌号；检测器首选检测器，根据目前研究结果，流动相合适时，蒸发光散射检测器可能更好，可积极研究，成熟时予以采用。采用的定量方法有：杂质对照品法，即外标法。仅限于对已知杂质的控制，如采用该法，则应注意对该对照品进行定性研究，并制订其质量要求。加校正因子的主成分自身对照法，即以主成分作对照的内标法，校正因子可在检测时测定，但需提供杂质对照品，也可在建立方法时将测得的校正因子载

14、人质量标准，供以后常规检验使用，无需长期提供杂质对照品，但也仅适于已知杂质的控制。不加校正因子的主成分自身对照法，实质上也是以主成分作对照的内标法，但其前提是假定杂质与主成分的响应因子相同，适用于具有与主成分相同或类似发色团的杂质，因一般情况下，有关物质与主成分具有相似的分子结构，此法不致发生太大误差。峰面积归一法，简便快捷，但因各杂质响应因子不一定相同、杂质量与主成分量不一定在同一线性范围、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不同等因素，可产生较大的误差。建议：校正因子在时可不予校正，即法，校正因子在以外时，应改变检测波长使在该范围内，如无法调节，应采用法。由于有关物质中有已知的亦有

15、未知的杂质，故采用或法与法相结合最为理想，同时控制产品中的已知杂质和未知杂质。使用法时，应在考察已知有关物质的校正因子（应位于以内）或结合二极管阵列检测结果（主成分与各有关物质的吸收偏差应不大）后采用，也可根据物料平衡原理（含量测定值与有关物质值的和与供试品理论总量的偏差）验证方法是否可行。一般不主张在质量标准中采用法，但可用于稳定性研究中对杂质变化的监测。含量测定色谱方法按外标法或内标法以峰高或峰面积进行定量。外标法当参考标准品与样品在不同的色谱图上进行分析时，用外标法。定量基于供试品的峰面积高（或）或强度（）与对照品的比值。更适合用外标法的样品为：样品具有单一的目标浓度和狭窄的浓度范围，例

16、如验收和出厂检验。简便的样品制备操作。，增加走基线的时间，为检测可能的额外峰，如杂质试验。内标法加入一种已知纯度并且在分析中不产生干扰的化合物至样品混合液中，定量基于被分析的化合物与内标的响应比值与参考标准品得到的比值进行比较，这一方法很少用于。更适合用内标法的样品如下：复杂的样品制备过程，如多次提取。低浓度的样品（灵敏度是确定的），如药代动力学的研究。在样品分析中预计是很宽的浓度范围，如药代动力学研究。内标法用于和减小测定误差，曾经起到很好的作用，特别是在中，进样量小，内标法能显著提高定量精度，随着现代分析仪器的发展，原手动进样已被定量环或自动化程度高的进样器所取代，内标法 的应用受到挑战，

17、尤其在中，由于进样量大，外标法已具有很好的进样精度，加入内标，有时反而对分析不利，笔者曾随机选取药典中八个内标法测定含量 的药品进行试验，结果表明，内标法均不能提高分析精度，实际上，内标法使分析误差与经常校准的外标法相比增加了倍，说明测定两个峰比测定一个峰引入的 误差要大。建议：外标法多用于原料验收、成品质控、稳定性和法，内标法多生物体液和法。保持供试品浓度与对照品浓度相近可以改善方法的准确性。峰面积与峰高定量峰 高定量仅在峰高随样品量呈线性变化时使用，当峰形不正或色谱柱超载时，峰高法会出现较大误差，由于峰高测量受相邻重叠峰的干扰较小，故比峰面积定量更为准 确，如中庆大霉素组份检测明确要求峰高

18、定量。峰面积定量的好处是其精度受仪器参数变化的影响较小，对不是高斯分布的峰形也能较好定量，但其准确度受 相邻峰重叠的影响。建议：为得到较好的精确度，宜用峰面积定量；为最大限度地排除其它组份的干扰，则多用峰高定量。痕量分析中几乎总是用峰高法定量。法的验证参数虽然许多种都可采用，但申报最多的方法是采用紫外检测器的反相法，以此作为验证参数的例子。本部分内容可以扩展到其它检测器和其它色谱。准确性准 确性是衡量测量实验值和真值的接近程度。推荐药物和药物制剂的准确性研究在标示量的、和的水平上来进行的，这与 “”的规 定是一致的。对 于药物制剂，准确性试验通常是将已知量的药物以检测浓度的线性范围量加到空白处方内来完成的，得不到准确的空白辅料时，可用标准加入法测定加样回收率，或 用本法所得结果与已经建立准确度的另一方法的测定结果进行比较；对于原料药，可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或同上与另一方法对比；对生物样品，可 用相对回收率表示。在每个推荐检测浓度重复进样，其重复进样式的提供了分析方法的变动性、或是试验方法的精密程度。重复性的均值以标示量的来表 示，这表明试验方法的准确程度。建议：药物回收试验在每个水平上（标示量的